6进化酶 酶工程与蛋白质工程 教学课件_精品.ppt

渐增切割法产生杂和酶 Incremental Truncation for Creation of Hybrid Enzyme, ITCHE 用核酸外切酶III分别消化两个非高度同源的靶基因，控制切割速度不大于10bp/min，每隔很短时间连续取样，迅速终止样品反应，以获得一组一次有几个甚至一个bp缺失的片断，然后将来自两个靶基因的片断随机混合，产生杂和基因文库，表达该文库，通过酶活测定筛选出理想的重组杂和基因。 * 不依赖于DNA序列同源性的随机重组文库的构建 * 同源序列非依赖性蛋白质重组（sequence homology independent protein recombination, SHIPRE） 将2个靶基因串联在同一载体上；PCR将α–硫代磷酸核苷酸随机掺入到扩增产物中；用核酸外切酶III处理产生不同截短程度的DNA片断，通过琼脂糖电泳回收与靶基因长度相似的随机片断，与表达载体连接重组，转化受体细胞，形成表达型杂和蛋白文库。 * * 表型观察选择和筛选:基于细胞生长率和生存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活性的筛选方法，主要依据强发色体底物(颜色变化)、易观察的克隆表现(溶解圈)或荧光产物来筛选突变体。 高通量筛选蛋白质突变体库的方法：如表面展示技术。 2、突变文库的筛选 * 噬菌体表面展示技术 Phage display techniques 将目的基因克隆在丝状噬菌体衣壳蛋白的基因中，使外源基因产物与衣壳蛋白融合，伸展在噬菌体表面，可用来直接检测表达产物的某些活性，从而实现基因型和表型的转换，提供了高效率的筛选系统，广泛应用于基础和应用研究。 * 基于三个原则： (1)在pⅢ和pⅧ衣壳蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别 (2)利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体 (3)外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来，实现了基因型和表型的转换 * * 在蛋白质工程中的应用： 将通过易错PCR、DNA改组等方法产生蛋白质或结构域的突变文库呈现在噬菌体表面，通过亲和筛选获得所需的已定向改变的噬菌体克隆，其一级结构可以从DNA的序列中推导出来，可用来筛选具有更强受体结合能力的细胞因子、新的酶抑制剂、转录因子的DNA结合新位点、新的细胞因子拮抗剂、新型酶和增强生物学活性的蛋白质等。 * 核糖体展示技术是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化的技术。基本原理是通过PCR扩增目的基因的DNA文库，同时加入启动子、核糖体结合位点等，并置于具有转录/翻译耦联的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成mRNA-蛋白质-核糖体三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT-PCR扩增，进行下一循环的富集和选择，最终筛选出高亲和力的目标分子。 核糖体展示 Ribosomal Display, RD * 核糖体展示 * mRNA展示技术 在mRNA的3’末端连入一个嘌呤霉素标记的DNA linker片段,体外翻译时核糖体会停在DNA linker与RNA之间的连接处,嘌呤霉素进入核糖体A位点,并在肽酰转移酶的作用下与天然多肽偶联。多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物与核糖体解离后,直接用于亲和性筛选。 * * 核糖体展示技术与mRNA-多肽融合技术基本原理类似,只是后者利用了嘌呤霉素将mRNA与多肽以共价键的形式联系起来,从而避免了核糖体展示中因缺少稳定的共价键使得核糖体三元复合物不够稳定的问题;另外mRNA-核糖体-多肽三元复合物中的核糖体由于分子量较大可能会影响靶标蛋白的筛选,导致高亲和力靶标分子的丢失,而mRNA-融合技术避免了此类问题,更适合于严谨条件下(如高温) 靶标分子的筛选。 * 与噬菌体展示技术相比较，核糖体和mRNA展示技术不需要将DNA库转化到微生物中，因此，库容量的大小不受转化效率的限制，库容量比噬菌体肽库高几个数量级。但是，核糖体展示和mRNA多肽融合技术都需要绝大多数核糖体能将蛋白质翻译完全，以使其能够正确折叠,这是筛选成功的关键之一。 * 细菌表面展示 细菌表面展示技术是利用基因工程手段将某一蛋白质或短肽段(靶蛋白)与细菌外膜蛋白(载体蛋白)以融合蛋白的形式呈现在细胞表面。 * 外源蛋白与载体蛋白序列融合方式： C端融合，如脂蛋白-外膜蛋白A(Lpp-OmpA)系统，其OmpA