10第三章 DNA重组技术讲解与基因.ppt

原核表达系统的重要元件（一）DNA复制及质粒DNA 载体为高水平表达提供模板 复制起点ori松弛型质粒大量复制; 含其他生物ori—穿梭载体 筛选标记基因筛选 Promoter Ribosome binding site Gene Terminator ATG TAA DNA RNA Protein 大肠杆菌中基因表达的重要信号 （二）目的基因的表达： 1.启动子:指导宿主转录目的基因,能被宿主RNA聚合酶识别、结合的特定短序列DNA 一 原核表达系统的重要元件 启动子：负责转录起始的元件。 在转录起始点-10区,-35区和二者之间隔为RNA聚合酶结合位点。 -10区:6碱基保守序列有TATAAT序列,有助于DNA的解链-35区是另一个6碱基保守序列。 -10区和-35区中心位置相距16-18bp时，该启动子的功能较强； 外源基因 常见的表达载体启动子 启动子 以启动子构建的载体 乳糖启动子（Lac） Pop203-13 色氨酸启动子(Trp)、 Pwt121 噬菌体的左向启动子（λPL） Pkc30，pPLc2833 杂合启动子（Trp-Lac，Tac） Pdr540 Pkk177-3 T7噬菌体启动子λPR pET系列 转录以操纵子为单位（操纵基因、启动子、调控序列）。 受IPTG诱导的表达载体 lac启动子：如PUC，pGEM，pSK等，表达的蛋白与β－半乳糖苷酶氨基端融合。 转录正调节:诱导lac启动子,需CAP（crp基因产物，cAMP激活蛋白）参与-CAPcAMP-，不能用以葡萄糖为炭源的培养基 阻遏蛋白 IPTG 启动子1 Lac I 调节基因 启动子2 操纵子 (阻遏蛋白结合部) LacZ’ 多克隆位点 转录负调控模式 2.核糖体识别位点:SD序列 3.翻译起始密码子 4.终止子 2.核糖体结合位点（SD序列） Shine Dalgarno 1974发现 起始密码子AUG和上游3-10bp处的6-9bp序列。富含嘌呤核苷酸，与核糖体16SrRNA富嘧啶序列互补,与宿主核糖体结合。 mRNA 5’—AGGAGGU-UUGACCU—AUG-- rRNA 3’-AUUCCUCCACUAG-- 对于形成翻译起始复合物\有效地进行蛋白质翻译是必需的. 其与核糖体3’末端的互补性和长度(与起始点距离)决定翻译的效率。 核糖体识别位点:SD序列 3.翻译起始密码子:ATG, 4.终止子 4.终止子（terminater）： 转录终止子：基因3’末端DNA特定序列（富含A/T富含G/C区域，后者有回纹结构），可被RNA polymerase识别，并形成RNA茎环结构酶释放--终止转录。 ρ终止蛋白：6个亚基 特异与单链RNA链结合，有ATP酶、解链酶活性, 终止位点与RNA酶结合，使RNA-DNA杂交体解体——产物释放——转录终止 原核生物转录-翻译偶联，调控主要在启动子、终止子(不同宿主有差别) 启动子 多克隆位点 阻遏物 终止子 基因 抗药性基因 DNA复 制起点 表达载体 三. 原核表达载体 外源基因在受体细胞中表达（克隆结构，重组子转移和复制，表达的相关元件） 表达载体需要考虑： 最优调控程序、强启动子、 合适的核糖体结合位点，质粒稳定性， 翻译的蛋白质性质、稳定，合适的宿主细胞。 （一）外源基因的表达产物 分为融合蛋白和非融合蛋白。