14Recombinant DNA technology知识讲稿教程文件.ppt

①分______分离出目的基因及载体DNA。 ②切______利用限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体。 ③接______利用连接酶将目的基因与载体DNA共价连接形成重组DNA分子。 ④转______重组DNA分子转化受体细胞。 ⑤筛______筛选和鉴定含有重组DNA分子的受体细胞（阳性克隆）。 重组DNA的基本过程 目的基因 基因载体 工具酶 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的获取 化学合成法 基因组DNA cDNA 聚合酶链反应 化学合成法 合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、 胰岛素原、 脑啡肽、干扰素基因等。 2. 基因组DNA（ genomic DNA） 利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。 ◆不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在染色体DNA的不同片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。 基因组DNA 基因片段 重组DNA分子 重组子 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 cDNA文库 把细胞总mRNA通过逆转录合成总cDNA，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物体全部cDNA集合，称为cDNA 文库 （ cDNA library）。 特点：1、代表了细胞 在取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。 2、mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。 聚合酶链反应 Polymerase chain reaction 体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。 原料：模板DNA（基因组DNA ，cDNA）一对特异性寡核苷酸引物，dNTPs 酶：Taq DNA聚合酶 反应条件：合适的缓冲液，三种变化的温度（94，50-70，72 ℃），一定的循环数（25-35） 反应过程：DNA模板变性（解链）、 模板与引物退火 、引物延伸 （多循环） 产物：目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍 二、克隆载体的选择和构建 粘性末端连接 平端连接 同聚物加尾连接 人工接头连接 三、外源基因与载体的连接 连接目的基因和载体，形成重组DNA分子。 1. 粘性末端连接 DNA连接酶 “缝合”基因的 “分子针线”。 2. 平端连接： 平末端用T4DNA连接酶连接，只是效率低，需要的DNA浓度更高。 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA G G CTTAA AATTC A TCTAG GATCT A Bg lⅡ切割位点 T4 DNA连接酶 15oC G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 AATTC G A TCTAG AATTC G GATCT A AATTC G A TCTAG + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如将poly（dC）加到双链DNA片段3‘ 羟基上，而将poly（dG）加到质粒载体3’ 羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。 3. 同聚物加尾连接 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 +