16重组DNA技术讲解.ppt

基因工程的基本步骤 1、分 2、切 3、接 5、筛 4、转 6、表达 基因工程的基本步骤 基因工程的基本步骤 基因工程的基本步骤 一、化学合成法 目的基因的获得 对已知基因的核苷酸序列，或蛋白质的氨基酸序列，推导出该多肽编码的核苷酸序列，用DNA合成仪经化学方法合成此基因。 【举例】胰岛素原、心钠素等 二、基因组DNA文库（鸟枪无性繁殖法） 目的基因的获得 OH 3? OH 3? OH 3? Oligo dT primer Double-strand cDNA OH 3? TTTnT 5? TTTnT 5? 3? OH AAAnA 5? Poly A tail mRNA Reverse transcriptase dNTPs TTTnT 5? AAAnA 5? OH 3? cDNA Alkali digestion of mRNA template cDNA DNA polymerase I dNTPs AAAnA TTTnT 5? OH 3? AAAnA TTTnT 5? 5? 3? S1 nuclease Single-stranded hairpin susceptible to S1 nuclease mRNA 三、cDNA文库的建立 目的基因的获得 四、DNA聚合酶链反应（PCR） 重组体构建 一、粘性末端连接 1、同一限制酶切割位点连接，碱基配对结合成重组分子。 2、不同限制酶切割位点连接，因有相同末端，经配伍后连接 DNA片段A DNA片段B 5′···G G A T C C···3′ 5′···A G A T C T···3′ 3′···C C T A G G···5′ 3′···T C T A G A···5′ 不同的限制性内切酶水解 混合后经DNA连接酶连接 BamHI BglII ···G G A T C T··· ···C C T A G A··· ···G G A T C T··· ···C C T A G A··· 粘端 重组体构建 配伍末端连接 Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined. 重组体构建 The optimal substrate for terminal transferase is the 3 OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long. 粘端的生成 二、平端连接 平端在T4连接酶作用下可以连接。 三、同聚物加尾连接 利用同聚物序列，如聚A与聚T之间经退火作用完成连接，需末端转移酶。 四、人工接头连接 用人工和成某酶切割序列的接头，与DNA平端相连后形成粘性末端再连接。 重组体构建 刘新文，重组DNA技术 重组DNA技术 刘新文 北京大学医学部生物化学与分子生物学系 第一节 概述 DNA克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（gene cloning）。 基因工程（genetic engineering）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技术（recombinant DNA technology） 一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等 1、目的基因（target gene）：cDNA或基因组DNA 2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等 cDNA （complementary DNA）：指体外经反转录合成的，与RNA （常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。 基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。 质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 3.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定