2-基因工程教学教材.ppt

第二章 食品与基因工程Food and Gene Engineering;教学目标;第一节 基因工程概述;1、基因概念;基因（gene）——生命的最大奥秘;DNA结构;3端;;1915年至1928年摩尔根的果蝇实验;1953年最伟大的模型 ——DNA双螺旋结构模型;DNA半保留复制;二、基因工程涵义;1、基因工程诞生的基础;;中心法则描述的是遗传信息传递表达路径的原理。;（2）基因工程研究的理论依据 基因可以重组互换 基因可切割 基因可转移 遗传密码是通用的 多肽与基因之间存在对应关系 基因可通过复制把遗传信息传递给下一代;（3）技术上的三大发明 60年代末－70年代：DNA分子的体外切割与连接技术。 70年代：基因工程载体的使用。 70年代： DNA分子的序列分析、琼脂糖凝胶电泳、杂交技术等。 1973年Cohen等体外构建细菌质粒的成功标志着基因工程诞生，这年定为基因工程诞生元年。;2、基因工程概念(Gene engineering);3、基因工程的主要内容;三、基因工程的一般步骤;生物材料;剪切;即基因工程是基因的一种操作平台与技术 基因工程五大基本操作单元： 切、接、转、增、检 ;工具酶 目的基因（制备） 基因载体 基因受体 ;第二节 工具酶;一、限制性内切酶 （Restriction endonuclease） 1、概念;I型酶：在识别位点很远的地方任意切割DNA链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。 II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需Mg2+，适合基因工程。 III型酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。 ; 1973年由H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌系编号、菌株名、分离顺序。 （1）用属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）组成的3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 （2）菌株名以非斜体符号加在前三个字母后面。如Ecok, EcoR （3） 同一菌株中有不同的限制性内切酶时，按分离顺序用罗马字母表示，正体书写。如EcoR I，EcoR V。 ;例如：流感嗜血菌d株 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d Hind Ⅲ;（1）作用机制 限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，在两条链的特定的磷酸二酯键上催化切开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。;（2）酶切特点;识别序列：限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列。（同分子中识别序列短的出现几率大，反之亦然） 稀切酶：能够识别长序列及富集GC和AT的识别序列（几率小）的内切酶。 同裂酶：识别相同序列的限制酶 同尾酶：识别序列不同，但切割得到的DNA片段具有相同的黏性末端。 各种类型见P18-19;黏性末端：被限制酶交错切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（5’粘性和3’粘性）;EcoRⅠ产生的5‘粘性末端;PstI产生的3‘粘性末端;例如：EcoR V 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 　 其切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。;反应底物 （DNA） 内切酶用量 （活力决定） 反应缓冲液 （最适pH 7.5） 适当的温度（37℃）;反应系统缓冲液;琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动， 不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：原理同，均为分子筛效应。 使用特点：琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。 ;;;;观察:凝胶成像系统;pBI121双酶切大片段的获得 Big fragment obtained from pBI121 afte