5 分子生物学研究方法技巧1.ppt

RNA的评价与鉴定 OD260/OD280=1.8~2.0 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。 利用mRNA的PolyA结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与PolyA杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以连抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。 2. mRNA的纯化 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图 3. cDNA的合成 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo dT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。 单链cDNA的3端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链. 煮沸 NaOH AAAAAAAAAAAAAA 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs 核酸酶 S1 cDNA第二链的自身引导合成法 cDNA第二链的置换合成法 RNA酶H在杂交体中的mRNA链上造成切口或缺口，E coliDNA聚合酶I以RNA片段为引物，合成DNA链，取代模板上的mRNA； 这些DNA片段经T4噬菌体DNA连接酶连接，形成完整的cDNA第二链。 4. cDNA文库的构建 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 步骤：在获得高质量的 mRNA 后，反转录合成cDNA，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 cDNA文库 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。 以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 cDNA文库的组建 cDNA文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 基因总量少，易筛选 cDNA文库的组建： 第四节 基因克隆技术 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子便是属于同一克隆。 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 克隆的定义 用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。 1. RACE技术（rapid-amplification of cDNA ends） cDNA末端快速扩增技术 RACE是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成 RNase混合物降解模板mRNA，纯化cDNA第一条链。 用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，以期得到目的片段，并可用nest PCR进行检测。 （1）5’ RACE 是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(d