5---基因工程和基因组学教学教材.ppt

/ 3 cDNA法 通过提取mRNA，然后进行反转录得到目的基因。 4 PCR法 用特异的引物，通过聚合酶链式反应来扩增目的基因。 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右 P C R 操作流程 90 0 C 50 0 C 70 0 C PCR 的三个步骤为一次循环，约需5－10 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。 4.2 目的基因和载体的连接 外源基因离开染色体是不能复制的。如果将外源基因连到复制子上，外源基因则可作为复制子的一部分进行复制。这种复制子就是载体。 载体可分为复制载体和表达载体。 表达载体是将外源基因在寄主细胞内表达成蛋白质的载体。 作为表达载体必须具有强的启动子和终止子，而且启动子必须是受控制的，所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 选择了载体后，就要将载体和目的基因在体外进行连接，即DNA的体外重组。 DNA的体外重组是依靠连接酶在体外将连接。 4.3 重组DNA导入受体菌 外源DNA与载体在体外连接成重组的DNA分子后， 需要将其导入受体菌。随着受体菌生长、增殖，重组 DNA分子得以复制、扩增、表达。 在选择了适当的受体菌后，经过特殊的方法处理后，使之 成为感受态细胞，具备接纳外源DNA的能力。 感受态的细胞制备有氯化钙法、电击发等。 4.4重组体的筛选 筛选就是将众多的转化菌落和菌斑区分开来，并鉴定 那一个菌落或菌斑所含的重组DNA带有目的基因。 筛选的方法有以下种： 常用的方法有以下几种： 1 遗传检测法： 如果载体携带有某些抗药性标志基因，转化后，只有含 有这种抗药基因的转化子细菌才能在含有该抗生素的培 养板上生存并且形成菌落。 抗药性： 以上两种方法仅仅是初步筛选。 插入失活： 载体一般含有多克隆位点，在没有外源DNA插入时该基因可正确表达，当外源基因插入时该基因就不能正确表达。这就是插入失活。 2 重组质粒的快速提取和酶切鉴定 3 PCR法 如果质粒中重组有外源基因，则可以先快速提取少量质粒 进行酶切，然后通过电泳法检查是否含有目的基因片段。 可提取质粒，用特异的引物进行扩增，如能扩增出目的基因 片段，则证明目的基因已重组入质粒。 4.5 克隆基因的表达 重组DNA技术的目的是为了扩增目的基因并且使目的基因 表达，实现生命科学研究、医药或商业目的。 克隆基因在受体细胞表达或大量生产涉及正确的基因 转录、mRNA的翻译以及后加工等问题。这些过程的 进行在不同的表达体系是不一样的，这些差别不但与 基因的来源、性质有关，而且与载体和表达体系有关。 常用的表达体系有原核表达体系和真核表达体系。 大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系。 真核表达体系有酵母、昆虫、哺乳动物细胞等。 五 基因工程的应用 (一)基因工程工业 (二)植物基因工程 (三) 转基因动物 (四) 遗传疾病诊断 (一)基因工程药物 ◆胰岛素的人工生产 (二)植物基因工程 根癌农杆菌介导的植物转化 ◆植物基因转化：是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。 ◆根癌农杆菌介导的植物转化 2. 基因枪转化技术 ◆通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到染色体上的方法。 ◆此法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。 * * */74 第九章 基因工程和基因组学 第一节 基因工程(Genetic Engineering) 基因工程概述 限制性内切核酸酶 载体 基因的分离与鉴定 基因工程的应用 基因工程概述 ★遗传工程 广义 狭义： 细胞工程、 染色体工程、 细胞器工程等 基因工程 ★1、概念： 　　是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。 基因工程概述 也称为DNA重组技术(DNA Recombination)、 　　　或　分子克隆(Molecular cloning) 基因工程的基本操作程序包括： (1) 目的基因的分离或合成； (2) 用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工 处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子； (3)把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和 载体上其他基因得以表达； （4）转化体细胞的扩增； （5）重组体细胞的鉴定与筛选。 ★2、诞生： 　1971年，美国Smith,H.O.　等分离出一种 　　　　　限制性酶，可酶切病毒的DNA分子； 　1972年：Ｂerg, P.　等 实现不同酶切DNA片