5基因工程与体外表达演示教学.ppt

(四) M13噬菌体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 (五) 病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。 二、表达载体 (一) 原核表达载体 表达载体中含有复制起始位点、抗性基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和转录终止信号. (二) 真核表达载体 载体中含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点。还含有真核表达元件,包括启动子、增强子和poly (A) 加尾信号。 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 第三节 基因克隆的基本过程 （二）从cDNA文库（cDNA library）中获得 （三）用聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增有关DNA片段 （四）人工合成 一、? 目的基因的获得 （一）从基因组文库中获得 二.载体的选择 三、DNA分子的体外连接 （一）黏性末端 （二）人工接头的使用 （三）加入同聚体尾 （四）平端连接 （一）黏性末端 定向克隆 （二）人工接头 （三）加入同聚体尾 （四）平端连接 四、外源DNA导入宿主细胞 将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有以下几种。 （一）转化（transformation） （二）感染（infection） （三）转染（transfection） 五、目的基因的筛选和鉴定 将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。 （一） 遗传学方法 插入灭活法 1. 2. 蓝-白斑筛选（α互补） （二） 免疫学方法 菌落原位杂交的原理 （三） 核酸杂交法 （四） PCR技术 PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。 (五) 酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白斑筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。 * 第八章 基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression 主讲： 陈慧勇 中南大学生物科学与技术学院 分子生物学研究中心 基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。 ?????第一节 基因克隆的工具酶 一、限制性核酸内切酶（restriction enzyme） 它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。 2．限制性内切酶的命名 EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 3．限制性内切酶的识别和切割位点 通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（sticky end）。 如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端： PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端： 有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Blunt end）, 如SmaⅠ： 二、其他常用的工具酶 1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I) 有聚合酶活性 有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用