8 DNA重组和基因工程基础教学教材.ppt

* 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 第8章 基因工程基础 第一节 基因工程概述 第二节 目的基因的获得 第三节 分子克隆中常用的载体 第四节 分子克隆中常用的工具酶 第五节 目的基因和载体连接、转化、筛选 第六节 基因工程和医药 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University DNA克隆 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合. 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning), 即无性繁殖. 技术水平: DNA克隆:分子克隆(molecular clone) 细胞克隆 个体克隆(动物或植物) 第一节 基因工程概述 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University DNA克隆: 应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA(同 源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的)与载 体DNA接合成一具有自我复制能力的分子—— 复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主 细胞,筛选出含有目的基因的转化子,再进行 扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克 隆或重组DNA(recombinant DNA). * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) :实现基因克隆所用的方法及相关的工作. 目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质) * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 第二节 目的基因的获得 一 目的基因的获得: 化学合成 聚合酶链式反应(PCR)方法扩增 建立基因组DNA文库 构建cDNA文库 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 化学合成法: 要求:1)已知目的基因的序列或其产物 的氨基酸序列 2)片段不宜太长 工具:自动化DNA合成仪 应用:1)合成PCR引物 2)寡核苷酸探针 3)人工接头序列及较小的基因 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University * 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 需要的物质:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),TaqDNA聚合酶 4种反应混合物经历变性、退火、延伸三步 94℃,热变性,双链解开 55℃,冷却退火,引物与模板的单链DNA 的特定互补部位相配对和结合 72℃,TaqDNA聚合酶作用下,新链延伸, 形成互补DNA双链 如此30个循环可获得230个基因片段 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 聚合酶链反应原理 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University Taq DNA聚合酶(Taq DNA pol,Taq pol) 1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真 菌,cetus公司首次分离纯化了该酶,分子量 94KD,该酶特点: 最适反应温度是75℃-80℃,能抵抗链分离所 需要的高温(94℃-95℃)的反复处理. * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 第三节 分子克隆中常用的载体 载体：为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达所采用的一些DNA分子. 基本特征: 能自我复制、有多克隆位点、有选择标记 常用载体有3大类: 1.质粒 2.噬菌体 3.病毒 * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Ya