8-10 基因操作原理与方法技巧.ppt

构建质粒载体的条件 1、复制子与质粒的拷贝数 2、选择标记：抗性基因。基因工程载体用得最多的Amp抗性基因、其次是Kan抗性基因，还有少量的Cm和Tc抗性基因。 3、分子量大小：2-10kb 4、尽可能多的单一限制酶切位点: MCS pBR322由三部份构成：pRSF2124的Amp基因，pSC101的Tet基因、pMB1的复制子(与Col E1类似)。Amp与Tet基因上有多个单一限制酶位点，外源基因插入其中可引起抗性的插入失活 克隆载体 克隆载体pUC18/19 pUC系列载体由pBR322的Amp基因、复制子和lacZ基因(来自M13mp质粒)组成， lacZ基因内有一由多个限制酶位点组成的DNA片段(多克隆位点，MCS)。pUC分子量较小，缺失了pBR322中控制质粒复制的rop基因，因而有较高的拷贝数，每子细胞中可高达500-700个分子。 克隆载体pUC118/119 pGEM-3Zf(+) pGEM系列载体与pUC，同样为分子量小，拷贝数高的质粒，也有lacZ基因，主要不同处是MCS两端的启动子和单链复制子不同，也提供了不同的MCS pGEM-3Zf(-) pGEM-5Zf(+) ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? pGEM-5Zf(-) ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? pGEM-T vector ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? pPoly2/sfinot pPoly2/sfinot为一很小的质粒，可克隆较大的基因片段 表达载体 在克隆载体的基础上发展而成。在克隆载体的适当位置插入与原核 或真核表达有关的元件(启动子、终止子)，并且在启动子与终止子之间有合适的MCS，即构建成了表达载体。表达载体一般要求有强的启动子和强的终止信号，有的还含有增强子。一些特殊用途的表达载体还有其它一些功能元件，如：调控序列、信号肽、跨膜区、定位表达等。 真核表达载体除有原核抗基因外，不少载体还有其它抗药性基因，这些基因的表达产物使转染细胞获得抗某些药物的能力。如：新霉素(Neo)、潮素(hygro)、dhfr(氨甲蝶呤) 原核表达载体 pET-28a(+) 原核表达载体 pET-28a(+) 原核表达载体 pET-28(+) 原核表达载体 pBV220 pBV220为我国科学家张智清构建，为温控型原核表达质粒，在我国已广泛应用 原核表达载体 pEZZ18 pEZZ18在MCS的上游有SPA的分泌信号序列，为一分泌性原核表达载体 真核表达载体 pcDNA3.1 pcDNA3.1含有CMV立即早期启动子与增强子、牛生长激素基因的终止信号，及Neo抗性基因。转染有该质粒的细胞在G418 (Neo类似物)的作用下能存活，而未转染的细胞则死亡，据此，可克隆得到稳定表达外源基因的细胞系。 真核表达载体pIRESneo pIRESneo含有CMV立即早期启动子与增强子、牛生长激素基因的终止信号，及Neo基因、提高mRNA稳定性的内含子IVS和核糖体进入位点(IRES)。IRES的存在可使同一mRNA分子上的2个ORF得以有效翻译。在抗性基因与外源基因分别由不同的启动子控制的表达载体中，由于外源基因丢失后，并不影响抗性基因的表达，此类型的载体转染的细胞在G418的作用下存活下来的约60%的细胞不表达外源基因。而该载体转染的细胞在G418的作用下存活的细胞大部份均表达外源基因。 真核表达载体pVAX1 为一结构简单的真核表达质粒，FDA同意其作为基因疫苗的载体 表面呈现真核表达载体pDisplay 该载体与pcDNA3结构类似。在其MCS的上游有引导分泌的信号肽序列，在MCS的下游有PDGFR基因的跨膜区结构域，该结构域编码的多肽将表达的外源蛋白锚定在细胞膜上。 真核表达载体pGFP-C1 该载体与pcDNA3.1结构类似。在MCS的上游有绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列，外源基因插入GFP的下游形成融合表达。可用于研究基因的表达定位