Chapter 3.Basic biology of plasmid and phage vectors知识讲稿教程文件.ppt

Chapter 3 Basic biology of vectors;目的基因进入原核或真核细胞并高效复制 和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。;克隆载体;表达载体; 报告载体;;报告载体; 常用的报告基因;一. 质粒载体;; 结构特性 DNA结构和物理学特征：质粒与染色体不同 a. 离心: 密度不同 b. agarose电泳: 分子量大小 c. 电镜观察: 1μm dsDNA=3000bp d. 再转化;;质粒的构建;人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：;构建质粒载体 (1)分子量尽量小。＞15kb时转化效率低。 小质粒优点:①容易提取； ②较为抵抗机械(超声波)切割； ③多拷贝，给克隆基因提供了剂量效应； ④对内切酶提供多切点的机会大为减少。 (2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。 (3)包含可供选择的标记性状(基因) (4)最大限度地具有MCS的单切点;常用质粒;1. pBR322 has an origin of replication, ori. This sequence is required to propagate the plasmid and maintain it at a level of 10 to 20 copies per cell. 2. The plasmid contains two genes that confer resistance to different antibiotics (tetR, ampR). 3. Several unique recognition sequences in pBR322 (PstI, EcoRI, BamHI, SalI, PvuII) are targets for different restriction endonucleases, providing sites where the plasmid can later be cut to insert foreign DNA. 4. The small size of the plasmid (4,361 bp) facilitates its entry into cells and the biochemical manipulation of the DNA. ;;;pUC18/19;重要的大肠杆菌质粒载体;穿梭质粒载体shuttle plasmid vector; ;质粒载体多种用途;质粒载体筛选方法;质粒载体缺点;1. ?噬菌体(phage);λ 噬菌体的生物学特性： λ 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 λ 噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 λ-DNA全长48502个核苷酸 λ-DNA上至少有61个基因;;cos位点（cohesive end site): 在DNA两端各有12nt的5`单链突出，彼此序列互补。它是包装时的切割信号。 ;;;λ 噬菌体生物学特性： 溶原状态 λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其 DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态. DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态 ;λ-DNA载体的构建：缩短长度 野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 ;;;;;;;λ-DNA载体的主要类型： 插入灭活型载体: Charon2、Charon6、λgt11 取代型载体λ: EMBL4、λgtλc、λNM762、Charon40 正选择型载体:λEMBL1、λL47、λ1059 ;λ-DNA重组分子的体外包装： λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装