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第四章植物基因工程在育种上的应用;转基因植物 ;世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。 ;转基因番茄?? ??1994年，美国研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。 ;转基因甜椒 ; 转基因油菜 ???? 油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。 ;??? 玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。 ;转基因牵牛花 ;本章主要内容： 第一节 目的基因的分离和克隆 第二节 植物基因工程载体 第三节 外源基因导入植物受体的方法 第四节 转基因植物的检测 ;第二节 植物基因工程载体;1．农杆菌载体系统 ①根癌诱导原理及Ti质粒 根癌农杆菌诱导的肿瘤称为冠瘿，而发根农杆菌则诱导发根。这些农杆菌中含有大量质粒，分别称为肿瘤诱导质粒(Ti质粒)和发根诱导质粒(Ri质粒)，这两种质粒均可使宿主发病。这两种病均是由Ti或Ri质粒的一些特殊组分转入植物细胞后与植物染色体进行功能整合而引起的。 后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小部分，即T-DNA或称转移DNA，被转入并整合到宿主植物核基因组中，而诱导形成冠瘿瘤的(Chiton等，1977)。;②Ti质粒的构成 Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、Onc区和Ori区共4个区段。 1 、Vir区(毒性区) 在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基 因。表达产物激活T-DNA向植物细 胞转移，使植物引发肿瘤。 2、 Onc区 含有农杆菌之间接合转移有关的基 因. 3、Ori区(复制起始区) 调控Ti质粒自我复制。 ;③农杆菌载体的构建 A．一元载体系统 有两种载体系统，即共整合载体(如pGV 3850共合体)和末端拼接载体(split-end vector，SEV)系统。 ; 中间载体与卸甲载体通过同源重组进行共整合 ;B．双元载体系统 双元载体系统由两个能在根癌农杆菌中自主复制的质粒组成：一个???在 T-DNA边界之间带有目的基因的穿梭载体(但更多是一个双元载体)；一个是辅助(helper)Ti质粒，该质粒带有vir基因，其产物有助于将DNA转移到植物细胞。 ;标准双元载体的组成成分： (1)多克隆位点； (2)广谱宿主范围的质粒复制起始点(如RK2)； (3)细菌和植物中的选择标记； (4)T-DNA边界序列(右边界序列是绝对必需的)。 双元载体的优点： 1)． 双元载体不需要在活体内进行同源重组。 2). 在农杆菌中，获得带有植物目的基因的双元载体系统比 较容易而且效率高。 3). 二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中.;2．病毒载体系统 目前，用于开发载体及转化的病毒有三种，他们主要采用基因插入和基因取代的方法构建载体： ①花椰菜花叶病毒(Caulimo viruses) ②双联体病毒 ③RNA病毒 ;①花椰菜花叶病毒(Caulimo viruses) CaMV的基因组由一个8kb的松弛的环状分子组成。基因组有两个区域，一个是ORFⅡ，编码昆虫传播因子；另一个是ORFⅦ，功能还不清楚。 将这两个区域缺失掉，用感兴趣的基因取代之。Brisson等(1984)用CaMV载体在芜青甘蓝细胞中获得了由细菌二氢叶酸还原酶基因编码的外源蛋白。这一结果证明CaMV基因组确实能被改建成植物基因工程病毒载体并把外源基因转入植物细胞。 已报道的克隆到CaMV载体中的基因都只有较短的核苷酸序列，插入位点都在ORFⅡ上，外源基因的表达多受病毒启动子的调节。 ;②双联体病毒 双联体病毒组中的每个成员均需具备两个元件，尽管这两个元件不必存在于同一个分子上，但它们必须是任意有功能的双联体病毒载体系统的组成部分。这两个元件就是一个复制起点和一个病毒复制必需蛋白。 到目前为止，大多数双联体病毒载体都很简单，只缺失外壳蛋白编码基因，可用报告基因或其他感兴趣的基因取代。 双联体病毒表达载体可以用于原生质体、培养细胞、叶圆片及植物体等几种不同系统中外源基因的转移、扩增及表达。;③RNA病毒 RNA病毒大致可分为三类: 第一类为单链RNA病毒，包括两种基本形式。一种形式是单一型病毒(monopartite)， 其基因组RNA包括全部遗传信息，当作为一个单顺反子被翻译时通常很大，如烟草花