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三 基于基因加标签的基因克隆方法 原理：主要在生物基因组中插入外源的一段DNA使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段已知的DNA片段来克隆基因的方法。 克隆基因的制备方法及原理 报告人：张凯 目录 克隆的介绍 克隆基因 克隆基因的条件 克隆基因的制备方法和原理 克隆的介绍 　　 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆 (Clone)”的术语。从此“克隆”这一词就诞生了。 克隆技术 又称为“生物放大技术”，它经历了三个发展时期： ⑴ 微生物克隆时期，即用一个细菌可以很快 复制出成千上万个和它一模一样的细菌，从 而变成一个细菌群； ⑵ 生物技术克隆时期，比如用遗传基因一DNA进行克隆； ⑶ 动物克隆时期，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”就是由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术； 克隆在不同水平上有不同的定义 1、在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2、在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。 3、在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆。因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 克隆基因 条件： 限制性内切酶 1 工具酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 单链核酸内切酶 核酸外切酶 DNA修饰酶 分类： 1 末端脱氧核苷酸转移酶：简称末端转移酶或TDT酶，来源于小牛胸腺，相对分子质量为34×103的碱性蛋白质。在二价阳离子存在下，它能催化d NTP加于DNA分子的3’羟基端。不需模板的存在就可以催化DNA分子发生聚合作用。4种d NTP任何一种都可以作为它的前体物。 主要用途：分别给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以使它们可以重组起来。 3 T4多核苷酸激酶（T4-PNP）：该酶从T4噬菌体感染的大肠杆菌中制备，它催化ATP的γ-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’-OH末端上，这种作用是不受底物分子链的长短大小限制，甚至是单核苷酸也适用。 主要用途：标记DNA的5’-末端，以供下一步的测序，S1核酸酶分析及其他须使用末端标记DNA的步骤，而且还可以对准备用于连接但缺失5’-P末端的DNA或合成接头进行磷酸化。 单链核酸内切酶 S1核酸酶：该酶来源于米曲霉菌，是一种高度单链特异性核酸内切酶，可降解单链DNA或RNA，产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。 主要用途：①从限制酶产生的粘性末端中移去单链尾部以产生平末端；②打开在从mRNA时产生的发夹环结构；③分析测定杂种核酸分子的杂交过程 Bal 31核酸酶（Bal31 Nuclease）：该酶来源于埃氏交替单胞菌（Alteromonas espejiana） BAL31株，主要表现为3’端的核酸外切酶活性，同时伴有5’端外切及内切活性。 特性：单链特异性核酸内切酶活性 双链特异的核酸外切酶活性 主要用途：①可控制性地截短DNA分子； ②定位测定DNA片段中的限制酶切位点的分布； ③诱发DNA分子发生缺失突变； 举例？ 核酸外切酶 它是一类在核酸水解酶中，具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶，与核酸内切酶相对应。 核酸外切酶Ⅶ:是一种促加工的单链核酸外切酶，能够从5′-末端或3′-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶。 主要用途：回收按dA-dT加尾法插入到质粒载体上的cDNA片段，也可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子。 ？ 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）：具有多种催化功能，可以降解双链DNA分子中的许多类型的磷酸二酯键。其中主要的催化活性是催化双链DNA按3′→5′的方向从3′-OH末端释放5′