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λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 例 目 录 目 录 三、原核表达载体（一）大肠杆菌表达载体 概念：用来在原核细胞中表达外源基因的载体。 特点：1、需有启动子（Lac、trp、tac、pL、T7）2、SD(AGGAGGU)序列和ATG。3、MCS.4、选择性标志的编码序列。5、转录终止序列。 分类：融合型蛋白表达载体：N-末端由原核基因编码序列与C-末端真核基因编码序列合在一起，转录和翻译成的蛋白质为融合型蛋白 非融合型蛋白表达载体。非融合型蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白。 （一）、pGEM单链系统 （二）、融合蛋白表达载体pGEX系统 特征：在MCS上游有Ptac控制谷胱甘肽巯基转移酶基因，Ampr，经修饰的 LacI阻遏蛋白基因， Lac操纵基因， Ori。 表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和插入基因表达产物的融合体。 优点：IPTG可诱导，表达产率高，分离纯化简便。 （三）、非融合型蛋白表达载体 pKK223-3 由PBR322构建，含tac强启动子，操纵基因，SD序列，PUC8多接头位点，Ori Tetr , Ampr, rrnBrRNA转录终止子. 使用该载体应使用LacIq宿主菌。 （四）、分泌型表达载体pINIII 系统. 特点：转录调控序列下游含大肠杆菌分泌蛋白基因，其中含有信号肽编码序列（s），表达产物通过细菌膜被加工后分泌到细胞间隙或培养液中。 四、真核表达载体 真核表达载体中含有一套真核表达元件，启动子和增强子—克隆位点—终止信号和加polyA信号. 原核启动子在真核细胞中是不起作用的，真核表达载体必须有真核启动子和增强子。(常用的有SV40病毒早期基因增强子,CMV ，Rouse肉瘤基因组长末端序列RSV，). 表达载体应有AATAAA和下游GT富集区。 （常用的加polyA信号来自SV40，是一段237bp的BamHI和BclI限制酶切片段）。可分为整合型载体和游离型载体。有酵母和动物病毒（痘病毒、逆转录病毒、腺病毒。） （一）酵母表达载体 1。整合载体，酵母整合质粒（YIp） 2。自我复制载体，在酵母中有自我复制的能力。有酵母复制型质粒（YRp）酵母着丝粒质粒(YCp)酵母游离型质粒(YEp) YEp含有酵母质粒的2μm环片段，可在染色体外自主复制，常用该质粒在酵母菌中高效表达外源基因。酵母菌的端粒为TTAGGG的重复序列，酵母线性质粒末端含丰富的G序列，可具有类似端粒的功能，可以线性分子形式复制。 （二）病毒表达载体 1。SV40载体.SV40病毒基因组为双链共价闭合环状DNA(cccDNA),是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒DNA。 SV40病毒基因组为基础的载体主要有两类。 取代型重组病毒载体和重组的病毒-质粒载体。 SV40载体类型 取代型重组病毒载体 去掉晚期区一段DNA，外源基因可插入 需辅助病毒感染 可形成病毒颗粒 重组病毒-质粒载体 保留病毒复制相关序列 插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌中复制增殖 不形成病毒颗粒 2。VV载体(痘苗病毒、天花病毒） 特点dsDNA，基因组180kb，可不依赖宿主细胞，独立在细胞质中进行复制和转录。 构建载体包括：tk基因（dTMP补救合成必需）， tk基因中插入病毒的早期启动子，下游MCS,供外源基因插入。重组体与野生型病毒共转染宿主细胞并经tk同源序列重组,获得既含外源基因又含选择标志基因的重组病毒。用HAT培养筛选。 构建重组痘苗病毒流程 tk基因插入质粒 tk基因内插入痘病毒早期启动子 接上多克隆位点 接上外源基因 野毒株感染细胞 导入重组载体 同源重组——含外源基因的tk基因取代 筛选含外源基因的重组病毒 感染敏感宿主细胞表达外源基因 胸苷激酶（TK）基因选择系统 TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶 内源性缺陷TK的宿主细胞——小鼠LMTK—细胞 HAT选择法 H：次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 T：胸苷；补救合成dTTP的原料 tk—细胞的鉴别与获得： 3。RV载体. 逆转录病毒为RNA病毒。由小鼠白血病病毒构建的载体含有5 ’和3 ’ LTR和包装信号，MCS取代了结构基因，pBR322的Ori和Ampr，另加有Hygr、Neor等作为筛选标志。 Neor的表达产物可使G418磷酸化而失活.不含重组体的细胞在含G418的介质中死亡，含重组体的细胞在含G418的介质中能存活。 新霉素抗性基因选择系统 新霉素（neo）：G418，一种氨基糖苷类抗生素，影响80S核糖体功能和蛋白质的合成