基因克隆知识讲稿教程文件.ppt

* 中山大学药学院 张革 * 野生型的λ噬菌体DNA两端各具12个核苷酸组成的粘性末端，可用来构建柯斯质粒（cosmid）。 * 中山大学药学院 张革 * 柯斯质粒载体 Fragments from 30 to 46 kb can be accommodated by a cosmid vector. Cosmids combine essential elements of a plasmid and Lambda systems. Cosmids are extracted from bacteria and mixed with restriction endonucleases. Cleaved cosmids are mixed with foreign DNA that has been cleaved with the same endonuclease. Recombinant cosmids are packaged into lambda caspids Recombinant cosmid is injected into the bacterial cell where the rcosmid arranges into a circle and replicates as a plasmid. It can be maintained and recovered just as plasmids. * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * （三）目的基因常用制备方法 1.化学合成法 较短的基因 100bp 大片段怎么合成？ 1977年，加拿大Itakara将人工合成的生长激素释放因子基因在E.coli中表达，这是首次高等生物基因通过基因工程高效表达并产业化。 干扰素、人胰岛素、加压素等的产业化生产 * 中山大学药学院 张革 * 2.PCR法 适用于克隆序列清楚的基因 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法 * 中山大学药学院 张革 * 3.cDNA文库法 cDNA（complementary DNA） 为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。 mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子； 在mRNA存在的3′末端的多A序列的核苷序列，外显子序列、先导序列以及后续序列等。 * 中山大学药学院 张革 * (四）载体DNA与目的基因的连接 DNA分子体外重组： 连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子（recombinant)的过程。 1.粘性末端的连接： 经双酶切获得粘性末端，用连接酶进行连接 2.平头末端的连接： 连接效率低，一般采用加尾法、接头法 3.连接效率： 目的基因与载体DNA的摩尔比大于1 * 中山大学药学院 张革 * 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 定向克隆 * 中山大学药学院 张革 * 问题： 如何加入合成接头？ 中山大学药学院 张革 中山大学药学院 张革 * 中山大学药学院 张革 * 基因工程-实验技术篇1.基因克隆 * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * * 1、限制性核酸内切酶 是一类能识别特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵作用。 一、基因工程菌的构建与筛选（一）工具酶 Covalent bond Hydrogen bond * 中山大学药学院 张革 * Ⅱ型酶 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。 * 1）II型限制性内切酶的基本特征 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5 EcoR I的识别序列 EcoR I的切割位点 * 中山大学药学院 张革 * * 2）核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端 ： 5’ - - - G A A T T C - - - 3’ I I I I I I I 3’ - - - C T T A A G - - -