基因工程(2014本科)知识讲稿教程文件.ppt

两文库的区别？在原核细胞中表达某真核细胞中的蛋白，应当选择哪个文库的基因作为基因表达的模板？ 第五节 重组体的构建、导入与筛选 一、DNA的连接 （一）黏性末端连接 （二）平末端连接 （三）人工接头连接 （四）同聚物加尾连接 （五）T-A克隆 第三章 基因工程 (Genetic Engineering) 第一节 概述 一、基因工程的基本概念 （一）基因工程的定义 将不同生物体的基因与载体拼接重组构成新的遗传组合，转入受体细胞后，使之稳定遗传并表达新性状的过程 （二）基因工程的基本过程 1. 目的基因与载体的获得（分） 2. 目的基因与载体的内切酶切割（切） 3. 目的基因与载体的连接（接） 4. 重组载体导入受体细胞（转） 5. 重组受体细胞的鉴定与筛选（筛） 6. 外源目的基因的扩增与表达（表） 二、基因工程的发展历史 1944年 遗传信息的携带者是DNA 1953年 DNA分子双螺旋模型的建立 1958年 DNA半保留复制方式的提出 1958年 中心法则的提出 1961年 基因表达的操纵子模式的建立 1966年 氨基酸的遗传密码的破解 20世纪60-70年代 限制性核酸内切酶、DNA连接酶、反转录酶的应用，大肠杆菌转化实验、电泳、杂交技术的建立 三、基因工程的应用 基因工程技术已经在农业、工业、环境保护与医学领域带来了巨大的经济与社会效益。其中，受益最多的是生物科学本身。 第二节 基因工程中常用的工具酶 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 连接DNA分子或片段 DNA聚合酶 合成双链cDNA中的第二条链 反转录酶 合成cDNA 多聚核苷酸激酶 催化核酸羟基末端磷酸化 末端转移酶 在3`羟基端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除5`末端磷酸基 一、限制性核酸内切酶 识别特异的DNA序列， 并在识别位点或其周围 切割双链DNA的内切酶 （一）限制性核酸内切酶的类型 （二）限制性核酸内切酶的命名法 H in d III 属 种 株 序 （三）限制性核酸内切酶的基本特征 大部分II型酶识别由4-8个核苷酸组成的特定序列；这些序列常常具有回文结构，即具有双重旋转对称结构的两条DNA链的碱基序列的反向重复； 切割DNA后产生5‘磷酸和3’羟基端；可以在两条链上交错切割形成单链突出末端——黏末端，也可以形成没有单链突出的末端——平末端； 同位酶 来源不同，识别序列相同，切割DNA的位点或方式可以相同或不同； 同尾酶 来源不同，识别序列不同，产生出相同粘性末端的酶； 可变酶 识别序列中的一个或多个碱基是可变的； 被相同的限制性核酸内切酶切割的两个DNA分子是否可以连接？ 第三节 基因工程中的载体 载体（vector）： 　　能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具 类型： 克隆载体、表达载体 宿主来源： 原核载体、真核载体 载体具备的条件： 1、具有自我复制能力； 2、有多个单一限制性核酸内切酶切割位点； 3、具有选择标志； 4、分子质量小，以容纳较大的外源DNA分子； 5、拷贝数高； 6、具有较高的遗传稳定性；　　 质粒载体 存在于细菌染色体之外的，具有自主复制能力的双链环状DNA分子 松弛型质粒适用于DNA重组中作为载体 接受15kb以下的外源DNA分子的插入 （一）pBR322质粒载体 （二）pUC质粒载体系列 第四节 目的基因的获取 目的基因： 待研究或应用的特定基因，亦即待克隆或表达的基因 一、从基因文库中筛选 二、cDNA的合成和克隆 三、化学法合成目的基因 基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) 含有某种生物体全部基因片段的重组克隆群体 cDNA文库(cDNA library) 含有某种细胞全部mRNA信息的重组克隆群体