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DNA分子的体外连接：方法 粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接 两种情况： （a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体 易自身环化。用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5`端P 基团，使5`端带一OH)处理载体，可防止载体自环化。 （b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶 切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。 碱性磷酸酶处理： 平头末端： （1）增加连接酶的量 （连接酶对平末端DNA的Km 约高于粘性末端DNA100倍 （2）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体连接。如加上一个人工接头内含GAATTC序列，用EcoRI酶切，产生EcoRI 粘性末端。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 加同聚物尾： 载体与片段没有共同的粘性末端时，可直接通过末端转移酶分别接上poly（dA）和poly（dT），然后退火，直接转化，分子间空缺部分可以在宿主体内修复。 同尾酶(xho I ;Sal I)  其他方法： Bgl II AGATCT TCTAGA BamH I GGATCC CCTAGG A GATCT TCTAG A G GATCC CCTAG G 连接策略： pCMV 选择连接位点： （1）HindIII粘性末端 载体自身环化，四环素失活,方向不确定。 （2）EcoRI--SalI定向，一般不会有载体自身环化，四环素失活 （3）XbaI-SalI反向，不能进行表达。四环素失活 （4）目的基因片段：Bgl II SalI，载体：BamH I SalI 反向，不能进行表达。四环素失活 （5） Not I--修平SalI 一个粘性末端，一个平端 SmaI--修平SalI 正向连接，四环素失活 PstI ？ SacI ？ 连接浓度： 片段与载体连接机率＞自身环化 一般计算公式： 粘性末端： 载体片段含量（ng）/载体长度（kb） 1 DNA片段含量（ng）/ DNA片段长度（kb） 3-5 平末端 1：5 10 ﹦ 连接反应： 10ul 体系 H2O Buffer Vector Insert ligase 4/14℃过夜 连接反应条件 连接酶的活性; DNA的纯度, 载体与目的基因的比例; PH值7.2-7.8适宜; 14℃(不高于16℃)过夜 连接体系：总体积10ul ddH2O 6ul 10*bf 1ul PBR322(4.3Kb) 1ul 弓形虫片断(1.1kb) 1ul T4 Ligase 1ul 混匀，小飞，25度4hr 连接酶：两种 DNA连接酶：连接双链中两条DNA链之间形成磷酸二酯键，封闭双螺旋骨架缺口。需要一条DNA链的3‘-末端具有游离的OH，另一条DNA链5’-末端的磷酸基团-P，吸能反应，需ATP存在。也可做DNA修复。但不能连接两条单链DNA分子和环化的单链DNA分子。而且只能连接粘性末端。 T4DNA连接酶：是从感染T4噬菌体的E．coli中分离得到的一种连接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接头。用途比DNA连接酶广泛，是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶。 其他酶：末端修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase） 　　简称末端转移酶。在合适的反应系统中，这种酶使DNA片段平末端的3′-OH加上同聚核苷酸，产生具有 poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。 碱性磷酸酶 　 根据DNA重组的需要，为防止两DNA片段末端之间连接，经常采用碱性磷酸酶处理，使DNA末端的5′-P成为5′-OH。目前采用的碱性磷酸酶有两种，即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）和来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10倍以上，而且对热敏感，便于加热使其失活。 配制含抗生素的平板