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基因工程-5-重组DNA构建与筛选演示教学.ppt
插入失活-环丝氨酸筛选法 四环素+环丝氨酸 氨苄青霉素 ②放射免疫筛选法1.放射免疫筛选过程A、制备抗原:培养菌落 (噬菌斑)B、制备抗体:免疫动物C、抗原抗体反应D、检测:放射自显影E、选出重组体 三重组DNA分子构建与筛选 一、粘末端DNA片段的连接 (一)具有相同粘末端的连接 EcoRI HindIII EcoRI 载体酶切 HindIII EcoRI 对基因酶切 (二)具有不同粘性末端的连接 用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后,在它们两端会产生非互补的突出端,经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。 HindIII 二、平末端DNA片段的连接 (一)直接用T4连接酶连接 (二)同聚物加尾法 优点: 接“尾”后的载体不能自身环化,提高了转化效率。缺点: ① 可能改变目的基因或载体的阅读框,影响外源DNA表达 ② 外源DNA无法收回 (三)衔接物连接法 衔接物是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成,具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。 (四) DNA接头连接法 接头的一端是齐平的,而另一端是某种内切酶的粘性末端 (五) PCR引入酶切位点 第三节 基因转移 一、重组DNA导入大肠杆菌 转化、电激法 二、重组DNA导入植物细胞的方法 载体介导、基因枪法 三、重组DNA导入动物细胞的方法 转染 一、重组DNA导入大肠杆菌 (一)转化 将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。 为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子,我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理,处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高,被称为感受态细胞。 1、转化过程 E.coli :感受态细胞+重组DNA分子 加入LB扩增 涂布选择性平板 2、DNA分子转化受体细胞过程 ①吸收:DNA分子吸附于受体菌表面 ②转入:双链DNA分子解链,单链DNA进入,另一条链降解 ③自稳:进入细胞内的单链又复制成双链环状DNA ④表达:目的基因随载体同时被复制,转录,翻译 3、质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响 (1)大小 > 10Kb,转化效率很低 (2)构型 超螺旋>环形>线状 热激法(Heat Shock Method) (三)电激法(electroperation) 电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。 可逆击穿:击穿小孔可在一定时间内复原。 不可逆击穿:击穿小孔不可修复,处理细胞成活率低。 1.电转化流程 (1)电转化感受态细胞的制备 (2)电转化操作程序 电击 复苏 涂布 (3)电击杯清洗 二、重组DNA导入植物细胞的方法 (一)载体介导的转化方法 1、共培养法(cocultivation) (1)原生质体共培养法 取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养,促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。 (2)叶盘共培养法 优点:适用性广,对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。 2、活体接种 (inoculation in vivo) (1)基因枪法 80年代末期,由康奈尔大学的Sanford最先提出,主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。 该方法是利用一种物理仪器装置,将钨、金等金属微粒加速冲击细胞,把细胞击孔,使目的基因进入受体。 基因枪所用材料: (1)钨粉使用起来经济实惠,也可以得到较好的转化效果;但容易被氧化,颗粒易聚集,并且对植物细胞的毒害也比金粉大。 (2)将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等,但多用前两种。 (3)所用动力系统:火药爆炸力 电弧放电 高压气体 基因枪法的特点:(1)转化效率高。 (2)受体广泛。 (3)操作简单。 (2)微注射法(micro-injection) 微量注射:用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔, DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头—道进入。 显微注射:利用显微注射仪,通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。 常用
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