基因工程制药-基因表达复习课程.ppt

;;1. 概述; 1973年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌，该重组质粒的以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性。 使得外源基因第一次表达;基因工程技术最成功的应用是用于新型生物药物的研制 DNA重组技术出现以前，大多数人用蛋白质药物从血液、尿液和动物的组织和器官中提取，成本高，产率、产量低，供应有限，易被某些病原体污染，存在不安全因素。 应用基因工程技术： ;c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源 性生理活性物质；？？ d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程（第二代基因工程）进行改造；？？ e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。;;3.受体菌的选择及分类 a.受体菌选择要求 ① 容易获得较高浓度的细胞，培养条件简单； ② 能利用易得廉价原料； ③ 不致病、不产生内毒素； ④ 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； ⑤ 容易进行代谢调控； ⑥ 容易进行DNA技术操作； ⑦ 产物的产量、产率高，且易提取纯化。 b.分类 ① 原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、 链霉菌等； ② 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ;（2）电穿孔法： 采用脉冲高压电瞬间击穿质膜使外源 DNA高效导入细胞，现在采用电穿孔仪进行。;4.2 外源基因导入真核细胞; 5.外源基因表达 外源基因表达：将外源的目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞的过程。 外源基因表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译，蛋白质产物的加工等过程。 基因高效表达：是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。 ;原核生物和真核生物基因表达过程示意图;5.1表达系统优缺点比较P21;5.2大肠杆菌体系中的基因表达; ⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 ???应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。;影响目的基因表达的因素;真核基因在大肠杆菌中表达的形式;载体的复制系列可分四类： ①Yep类（yeast episomal plasmid， 酵母附加体质粒） ②YRp类（yeast replication plasmid， 酵母复制型质粒） ③YCp类（yeast centromeric plasmid， 酵母着丝粒质粒） ④YIp类（yeast integrative plasmid， 酵母整合型质粒）;影响目的基因在酵母菌中表达的因素 ;谢谢！; 内源性活性物质已广泛运用于美白、保湿以及抗衰老等功效型化妆品中。以具有抗衰老功效的化妆品为例类护肤品中多数都含有维生素C、E，神经酰胺，透明质酸，超氧化物歧化酶SOD等天然内源性物质。 ; 由于翻译常从编码甲硫氨酸的AUG（起始效率:AUG=2GUG=4UUG）密码子开始,目的蛋白的N端常多一个甲硫氨酸的残基，会引起免疫反应; ; 融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的，氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。 非融合蛋白是指在大肠杆菌中表的的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，氨基端不存在任何细菌多肽的序列。