基因工程基本基础操作过程(目的基因与运载体结合).pptx

目的基因与运载体结合;基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等 ;1.提取目的基因 2.目的基因与运载体结合 （基因表达载体的构建）是基因工程的核心。 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测和表达 切、接、转、增、检; 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用. 基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因．将两者连接起来，将目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩增或正确表达。 ;依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是： (1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白至关重要。 (2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析，则需考虑选择适当的报告基因，并将可能具有调控机能的目的基因置于报告基因的上游适当位置。 若调控基因可能有增强子作用，还应在报告基因下游适当部位插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。 ;;为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互相连接，形成新的重组分子。 ; 当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时，必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种末端的转换通常用以下三种方式转换： ① 3’凹???补平：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全补平，产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA相连接。 ② 3’突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3’- 5’外切核酸酶活性，可将3’突端切除。 ③ 平端加上人工合成接头：合成接头是自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。;载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片段末端性质不同，可有下述不同的连接方法： 　 ① 粘性末端连接法 　② 平端连接法 　 ③ 同聚物加尾连接法 　④ 人工接头连接法 ;1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组DNA分子. 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。; 2.不同限制酶切位点连接: 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、具有相同类型的粘性末端，彼此称为互补末端也可以采用粘性末端连接。 外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可先生成黏性末端再补平）。 ;双酶切片段的定向克隆的优点; 一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。 适用于限制性内切酶切割产生的平端 适用于粘端补齐或切平形成的平端? ;提高平头末端连接效率的方法包括： ①加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） ②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会； ③加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用； ④加入单价阳离子（NaCl）。 ;?当载体和外源DNA片段两端的酶切位点之间，不可能 找到恰当的匹配时，解决方法： ⑴人工接头连接法：通过依次加入、连接合成DNA接 头，再用限制酶切加以解决。 ⑵同聚物加