基因工程概论2教学教材.ppt

（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶---“基因剪刀”;作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;BamHⅠ;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;（三）目的基因 （target DNA）－“乘客”;（四）基因载体—“交通工具汽车”;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;1. 质粒 (plasmid);;含有的lacZ基因编码了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外源DNA后，α片段不能正常合成;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;3. 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;1* 化学合成法获取目的基因;基因组DNA文库（genomic DNA library） 将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库;cDNA文库(cDNA library)： 以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。;DNA文库;Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。; 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;5?;Cycle 3;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ; 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等; a 互补;重组DNA技术操作过程可形象归纳为 ;重组DNA技术操作的主要步骤;表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化;标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点;大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 ;优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 使用穿梭载体，有两套复制原点及选择标记 缺点：操作技术难、费时、不经济;表达载体pFASTBACI 的物理图谱;;Dolly, the first mammal to be cloned from an adult cell, Is shown here with her naturally conceived first lamb, Bonnie.;（一）疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并