基因工程载体教学教材.ppt

1 第五章. 基因工程载体 2 载体类型基因工程所用的载体都经过人工重新构建 细菌质粒载体 噬菌体衍生载体 Cosmid载体（粘粒） 噬菌体M13衍生载体 Phagemid载体 酵母质粒载体 真核病毒载体 3 克隆载体与表达载体 克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并 使外源DNA大量扩增。 表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。 4 第一 节. 质粒 Plasmid 质粒是存在于细菌细胞染色体外、 能自主复制的小分子环状双链DNA分子。 又称为cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。 5 野生型质粒的大小一般在2-200Kb 基因工程常用者在2-4Kb之间 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。 6 质粒 (plasmid) 7 1 .质粒类型: 严紧型质粒(stringent plasmid) 1-5个拷贝/细胞 松弛型质粒(relaxed plasmid): 数十个/细胞 质粒在细胞中的拷贝数有时与寄主的种类有关。 8 2. 质粒载体必须具备的条件 （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 （2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。 10 质粒性质 　　　不相容性（不亲和性） 具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。 11 3. 质粒载体的选择性标记 抗菌素抗性 新陈代谢特性 12 抗菌素名称 抗菌素作用方式 宿主菌抗性机理 氨苄青霉素（Amp） 干扰细菌细胞壁合成 编码-内酰胺酶,切割Amp -内酰胺环 氯霉素（Cml） 抑菌剂,与50S结合,干扰 编码乙酰转移酶,使氯霉素 蛋白质合成 乙酰化失活 卡那霉素（Kan） 杀菌剂,与70S结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶, 发生错读 修饰Kan失活 链霉素（Sm） 杀菌剂,与30S结合,mRNA 编码特异修饰酶 发生错读 四环素（Tet） 抑菌剂,与30S结合，阻止 编码特异蛋白,修饰细菌膜 蛋白合成 结构,阻止Tet通过细胞膜 13 复制起点 氨苄青霉素抗性基因 14 常用的质粒载体 　1.　pBR322 　2.　ｐＢＶ220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体。 　3.　pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。 15 16 17 18 4.融合表达载体 　　　如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST与目的蛋白的融合体。 19 融合表达载体的优点 表达效率高 融合蛋白易纯化： 抗GST的蛋白质作为特异性抗体， 用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白； 可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。 　 20 例如加装一段编码　Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子Ⅹa切割，从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。　 21 QIAexpress 6His表达系统 重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。 6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结构和功能，无需切除。 6个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以直接用做抗