苹果SOD测定方案.doc

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：苹果果肉（二）仪器设备：1. 高速台式离心机 ； 2 . 分光光度计 ； 3. 荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；4.试管，离心管。 （三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml； 3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存； 4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； 5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 三、实验步骤 1. 酶液提取 取苹果阴阳面果肉0.5g于预冷的研钵中，2ml预冷 的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于5000rpm下离 心10min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5；130mmol/L Met溶液0.3；13mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.3；75μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.3；10μmol/L 20μmol/L 核黄素0.3；20μmol/L 酶液0.05；2支对照管以缓冲液代替酶液；蒸馏水0.25，总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应10min（要求各管受光情况一致，温度高时时间缩短，低时延长）。 3. SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。 四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。 以抑制蓝色形成的50％为一个酶活单位。按下式计算： 样品酶活单位= 式中s——样品照光后的透光度； a——未加酶之反应液照光后透光度； b——未加酶之反应液照光前透光度； n——酶液稀释倍数。 样品酶活单位表示，SOD酶活单位（U）/g干重（g 鲜重或g蛋白）。