第10章讲外源基因表达与基因工程药物.ppt

外源基因表达与基因工程药物 ;第 一 节概述;一、基因表达基本原理　??? ;基因工程（genetic engineering);转录与翻译各有两种模式：原核生物与真核生物转录 ;宿主细胞表达的外源蛋白的属性涉及： ① 目标蛋白是否是糖基化蛋白 ② 真核生物蛋白三维结构的复杂程度;二、基因表达基本类型　??? ;第 二 节外源基因表达基本过程; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;重组DNA技术的发展史;一、目的基因的获取;化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;限制酶切位点;mRNA ;（一）载体;载体的共同特征;;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。;1. 质粒 (plasmid);;; λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;粘性质粒(cosmid); 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;需要的工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ;与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称异源同工酶或同裂酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;名　　称　　 　识别序列及切割位点;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;平端连接 ;目的基因;宿主细胞条件： 限制酶和重组酶缺陷 易于重组子导入 遗传稳定性好 安全性高 功能互补 具有较好翻译后加工机制 蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低 ;导入方式： 转导（transduction) 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection);转导（Transduction）;λ噬菌体的生活史;转化（Transformation）;如：细菌感受态制备、重组体转化及筛选;LB 0.18M ; 1. 根据表型特征或遗传标记筛选 (1) 抗药性标记选择 (2) 蓝白筛选 2. 噬菌体的溶菌性和溶源性 3. 利用核酸探针筛选 4. 限制性内切核酸酶图谱筛选 5. PCR筛选 6. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等;(插入失活法) 抗药性标记选择; α互补; 原位杂交; Southern印迹;鸡的β肌球蛋白的克隆和检出;重组DNA技术操作过程可形象归纳为： ;重组DNA技术操作的主要步骤;表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化; 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。;原核基因转录调控以操纵子模式进行 ;操纵子模型的普遍性;是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。;2、操纵序列 ——阻遏蛋白(repressor)的结合位点;（一）乳糖操纵子(lac operon)的结构;mRNA;mRNA;原核生物mRNA作为模板进行翻译的效率与强度与SD序列的碱基排序和组成以及其与起始密码子ATG的间隔相关：;S-D序列;mRNA序列上紧接S-D序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别并结合。;大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 ;; 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济;真核基因顺式作用元件影响基因转录活性;CCAAT盒;增强子(enhancer);新生多肽链不具备蛋白质的生物学活性，必须经过复杂的加工过程才能转变为具有天然构象的功能蛋白质，这一加