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第14章讲 基因重组和基因工程.ppt
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic Engineering;第 一 节DNA的重组 DNA Recombination;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination),又称基本重组。是最基本的DNA重组方式,通过链的断裂和再连接,在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 ;Holliday模型中,同源重组主要4个关键步骤 ; 内切酶
(recBCD);二、细菌的基因转移与重组;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;例:溶菌时,裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;(三)转导作用;λ噬菌体的生活史;;第 二 节 重组DNA技术;相关概念
DNA克隆
工具酶
目的基因
基因载体
基本原理
重组DNA技术与医学的关系;一、重组DNA技术相关概念 ;DNA克隆
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;(二)工具酶;限制性核酸内切酶;作用
在细菌体内,与相伴存在的甲基化酶(methylase)共同构成细菌的限制-修饰体系(restriction-modification system),限制外源DNA,保护自身DNA,对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;
第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;
第四个字母代表株;
用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;(三)目的基因;(四)基因载体; 质粒 (plasmid);二、重组DNA技术基本原理; 以
质
粒
为
载
体
的
DNA
克
隆
过
程;(一)目的基因的获取;(三)外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接;2. 平端连接
适用于:限制性内切酶切割产生的平端
粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase)的作用下,在DNA片段末端加上同聚??序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。;5′
3′;4. 人工接头(linker)连接
由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件
安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent) ;(五)重组体的筛选
1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择
(2) 标志补救(marker rescue)
(3) 分子杂交法
原位杂交
Southern印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等;原位杂交;Southern印迹;重组DNA技术操作过程可形象归纳为 ;重组DNA技术操作的主要步骤;表达体系的建立
表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产物的分离纯化;1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用)
标准:选择标志 强启动子
翻译调控序列 多接头克隆位点
E.coli表达体系的不足
不宜表达真核基因组DNA
不能加工表达的真核蛋白质
表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body)
很难表达大量可溶性蛋白;优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA
可适当修饰表达的蛋白质
表达产物分区域积累
缺点:操作技术难、费时、经济;(一)疾病基因的发现与克隆
根据基因定位克隆之并研究其性质,而认识疾病的分子机制。; 重组DNA医药产品;;(四)基因治疗
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