第18章 重组DNA技术讲解.ppt

3. 哺乳动物表达载体 ◆ 哺乳动物细胞表达外源蛋白的优势是可被修饰。 ◆ 常用的哺乳动物细胞表达宿主： 中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 猴肾细胞(COS)等 ◆ 哺乳动物细胞表达载体一般为穿梭型载体，含有真核细胞表达相应序列，如Invitrogen公司开发的pcDNA3.3-TOPO。 哺乳动物表达载体pcDNA3.1 第 三 节 重组DNA操作的基本过程 Section 3 Protocols of DNA Recombination DNA重组的基本过程： 1. 靶基因DNA片段的制备 2. 适宜载体的选择和制备 3. DNA片段与载体的连接 4. 重组DNA转化宿主细胞 5. 含有重组DNA宿主菌的筛选 6. 重组DNA分子的鉴定 基因组DNA 质粒载体 限 制 酶 目的基因序列 重组后含有外源基因的载体 DNA 连接酶 转化 扩增 重组DNA技术的基本步骤 一、目的DNA片段的制备 ◆ 来源与方法：基因组DNA、cDNA、PCR产物和化学合成的DNA。 ◆ 基因文库(gene library)：也称基因组文库(genome library)，用限制酶切割基因组DNA获得成千上万的在一定大小范围内的DNA片段，每一个DNA片段与载体分子连接，产生一个重组DNA分子的混合物，重组DNA分子转化宿主菌后，每一个转化细胞含有一个重组DNA分子，这些克隆的集合体被称为基因文库。 基因组文库的构建 ◆ cDNA文库(cDNA library)：提取细胞总mRNA，经反转录获得总cDNA，每一个cDNA分子与载体连接产生了一个重组DNA分子的混合物，再转化宿主菌，每个宿主菌细胞克隆将含有一个cDNA重组分子，这些克隆的集合体被称为cDNA文库。 ◆ 若目的序列全部已知，可以通过人工合成的方法获取靶序列。 ◆ 已知目的序列两端序列时，可以通过PCR方法获取靶序列。 cDNA文库的构建 二、载体的选择与准备 ◆ 选择原则：依据重组DNA的目的，选择适当载体。 适合的选择标记 克隆载体 表达载体 细菌载体 酵母载体 昆虫细胞载体 哺乳动物细胞载体 三、DNA分子的体外重组 ◆ 互补性粘性末端将使连接更容易。 限制酶粘性末端连接 T-载体粘性末端连接 平末端连接 同聚物加尾连接 人工接头连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 限制酶粘性末端连接 目 录 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 目 录 平末端链接 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 目 录 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 目 录 四、重组DNA分子导入宿主细胞 1. 转化 ◆ 转化(transformation)：质粒DNA分子导入细菌宿主，并使其获得新表型的过程。 三种方法：转化、转染和感染。 ◆ 感受态细胞(competent cell)：指经过处理后变得更容易接受外源DNA的细菌细胞。如使用CaCl2处理E. coli细胞，可获得E. coli的感受态细胞。 2. 转染 ◆ 转染(transfection)：将重组DNA分子转入真核细胞的过程。 ◆ 转染细胞：接受了外源DNA分子的宿主细胞。 ◆ 稳定转染(stable transfection)：