第20章 重组DNA技术讲解.ppt

4. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA ′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 5. T-A克隆 是直接将PCR产物插入到载体中的方法。 第五节 重组分子的导入和筛选与鉴定 一、重组DNA分子的导入— 转 二、重组DNA分子的筛选与鉴定—筛 一、重组DNA分子的导入 宿主细胞应具备的条件 处于感受态 对载体无严格限制 限制酶和重组酶缺陷 不对外源DNA进行修饰 能表达重组体所提供表型特征 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) 磷酸钙转染 DEAE-葡聚糖介导转染 电穿孔转染 脂质体转染 显微注射 非转化子 转化子 非重组子 重组子 鉴定 单抗生素筛选 非转化子(不能生长） 转化子 阳性重组子 自身环化载体 未酶解完全载体 非目的基因插入载体 二、重组DNA分子的筛选与鉴定 直接选择法 抗药性标记选择 标志补救 (marker rescue) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 重组子的筛选与鉴定方法 作用模式图： （2）连接平末端 Alu I *************AGCT************** *************TCGA************** 5′ 3′ 5′ 3′ —OH — P 5′ 3′ 3′ 5′ ************TC ************AG 5′ 3′ 3′ 5′ OH— — P CT************* GA************* DNA连接酶 能够把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用 类型： 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 Taq DNA聚合酶 反转录酶 三、DNA聚合酶 四、其它修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase） 多核苷酸激酶（polynuleotide kinase） 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 功能： 催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。 (1) 底物是单链DNA或有3′突出末端的 双链 DNA。 OH 5′ 3′ Mg2+ dNTP 5′ 3′ (A、G、C、T)n nppi 5′ 3′ OH Mg2+ dNTP nppi 5′ 3′ (A、G、C、T)n 末端转移酶 (2) 底物是平端或3′ 凹端的双链DNA。 5′ 3′ Co2+ dNTP 5′ 3′ (A、G、C、T)n nppi 5′ 3′ Co2+ dNTP nppi 5′ 3′ OH OH (A、G、C、T)n 用途： （1）主要作用是在载体或目的基因 3′ 末端加上同源多聚尾巴，形成人工 黏性末端，便于DNA重组。 （2）DNA 3′末端的同位素标记。 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷