第8章讲 基因工程原理1.ppt

（5） 同尾酶（isocaudamer）：来源不同，识别的靶序列也不同，但是切割后产生的末端相同的酶。 来源 识别序列 切割序列 同裂酶 （异源同工酶） 不同 相同 相同或不同 同尾酶 不同 不同 相同 同裂酶与同尾酶比较 Principles of Gene Engineering 3.2 DNA连接酶 1967年第一次从细菌中发现 DNA 连接酶(ligase)，后来从噬菌体等中也发现有连接酶存在。又被称为“分子胶水”。 连接机制：催化相邻的3’-OH与5’-P之间形成磷酸二酯键。 Principles of Gene Engineering 常用的DNA连接酶：大肠杆菌的ligase：只能连接粘性末段，不能连接平末段；T4 ligase：可以连接粘性末段或平末段。 在分子生物学中的应用：用于DNA片段之间的连接。 Principles of Gene Engineering 3.3 反转录酶(逆转录酶) （1）反转录酶的组成和性质 反转录酶是一类独特的DNA聚合酶，以RNA为模板，指导DNA的合成。又称为“依赖RNA的DNA聚合酶”。1970年由Temin等首先在鸟类致病的RNA病毒中发现。由一条多肽链组成，但有多种酶的活性。 Principles of Gene Engineering （2）反转录酶在基因工程中的应用 反转录酶在基因工程中最主要的用途就是将RNA反转录成DNA。 Principles of Gene Engineering 反转录酶催化从RNA合成 cDNA Principles of Gene Engineering 3.4 其他酶 DNA聚合酶I ,反转录酶 T3, T7, SP6 RNA聚合酶, Taq DNA 聚合酶 聚合酶 末段转移酶, T4多核苷酸激酶, 碱性磷酸酶 修饰酶 绿豆核酸酶, 核酸酶S1外切酶III, DNaseI, RNaseA, RNase H 核酸酶 Principles of Gene Engineering 4 基因工程中的载体和宿主系统 4.1 基因工程中载体系统 载体的概念、特征、发展历程和类型 常用的载体类型及其特征 4.2 基因工程中的宿主系统 Principles of Gene Engineering 4.1 基因工程中载体系统 4.1.1 什么叫载体(vector ) 载体就是来源于大肠杆菌或噬菌体等的DNA, 可供外源DNA插入并将外源DNA导入宿主细胞的片段。 Principles of Gene Engineering 由于单独的外源DNA片段不能在细胞内长期存在, 所以载体的作用就是使目的DNA能够长期在细胞中存在下去。 这是因为载体是一个独立于染色体外的, 可以自主复制并遗传的单元。 Principles of Gene Engineering 4.1.2 作为克隆载体的基本条件 a 有自主复制能力（即本身是一个复制子）， 或整合到基因组DNA中,但仍保持独立。 b 有合适的可供外源基因插入的克隆位点(单克隆或多克隆位点)，外源基因的插入不影响其自主复制能力。 c 具备选择标记，以便对重组子进行筛选。这些标记包括对抗生素的抗性、氨基酸的合成酶、噬菌斑形成、产生色素等。 Principles of Gene Engineering d 除保留必要序列外，载体本身应尽可能的小，便于导入细胞和在细胞内生存繁殖。可以携带一定长度的外源DNA片段并有较高的拷贝数。 e 使用安全。可隆载体只能生长在有限的宿主细胞内，在体内不能进行重组，细胞间不能发生转移，不产生有害性状，不能离开工程宿主自由扩散。 f 其他特殊要求。 Principles of Gene Engineering 4.1.3 载体发展的历程 载体的构建发展经历大约3个时期： （1）第一阶段： 主要依赖天然存在的质粒。如Cohen最早使用的pSC101。后来对载体进行了一系列的改造，如删除非必需序列、引入标志基因、减少酶切位点等。如pBR322就是经过改造的质粒，使用非常广泛。经过改造，质粒在细菌体内的拷贝数均达到几十以上，甚至上百，上千。 pBR322成为现今多种质粒的来源。 Principles of Gene Engineering 4.1.3 载体发展的历程 （2）第二阶段：20世纪70年代后期至80年代中期。构建出了一大批相对分子量小、拷贝数多、有多种特殊性能的载体。以pUC系列载体著名，集中了当时载体的诸多优点。并在此基础上发展出pUC载体系列，可以满足多种需要。此外，用于酵母、昆虫、高等动植物基因工程的各种载体也得到了发展。 Principle