第五-六章 分子生物学研究方法技巧-2008-5-9-修改.ppt

第五-六章 分子生物学研究方法;第一节 重组DNA技术;2、分子生物学史上的重大事件： ● 1869? F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 ● 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 ● 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。 ● 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 ● 1957? A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 ● 1958? M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 ● 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。;● 1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。 ● 1965?S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。 ● 1966?M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 ●第一次发现DNA连接酶。 ● 1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 ● 1972-1973?H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 ● 1975-1977?F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。 ● 1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。 ; ● 1978?首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 ● 1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 ● 1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 ● 1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 ●1983?获得第一例转基因植物。 ● 1984?斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 ● 1986?GMO首次在环境中释放。 ● 1988?J. D. Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。 ;● 1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--“Oncomouse”。 ● 1992?欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb) ● 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。 ● 1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 ●1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 ● 2000 完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定（1.2×108bp) ● 2001完成第一个人类基因组全序列测定（2.7×109bp) ● 2005中、美、日联合完成水稻基因组序列测定;●相关概念 ●工具酶 ●基因载体 ●基本原理 ●重组DNA技术的意义;一、相关概念 ;重组DNA技术中常用的工具酶;◆限制性核酸内切酶;3、作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;三、基因载体;◆克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 ◆表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。; （1）、质粒 (plasmid):(可插入5kb左右）;PBR322; 溶菌性（Lytic）：在细菌中连续增殖直到细菌裂解时，释放噬菌体。 溶原性（Lysogenic）：将其DNA整入细菌中。 *只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周期。;四、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;1、目的基因的获取 ;（1）、 化学合成法获取目的基因：;2、克隆载体的选择和构建;3、外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切