第五章+分子生物学学习研究法-基因工程.ppt

第五章 分子生物学研究法 八. 基因工程 基因工程的主要内容或步骤: 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 载体的选择, 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选 择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞。 第五章 分子生物学研究法 一. 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序的四个过程: 目的基因的获取 基因表达载体的构建 目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 第五章 分子生物学研究法 目的基因的获取 生物材料 mRNA 限制性内切酶 一定大小范围DNA片段 cDNA 反转录酶 基因组文库 cDNA文库 基因文库 人工合成 获得目的基因 DNA PCR 1. 目的基因的获取 第五章 分子生物学研究法 目的基因的获取 目的基因的获取: PCR扩增 基因文库 化学合成法 DNA片段 cDNA片段 基因组文库 cDNA基因文库 第五章 分子生物学研究法 基因表达载体的构建 2. 基因表达载体的构建 1) 基因表达载体的选择 2) 目的基因与载体的连接 第五章 分子生物学研究法 图: EcoR I 和Pvu II 双酶切质粒载体 和目的基因及目 的基因与载体的 连接。 * 这种连接方式称为 取向退火形成重组 DNA分子。 Pvu II 载体末端 载体末端 目的基因 插入的目的基因 Pvu II 第五章 分子生物学研究法 - 用不同的酶酶切产生的带有相同突出端的两个片段在连接 酶作用下可连接。 如: BamH I 5’G|GATCC Bgl II 5’A|GATCT C CTAG|G5’ T CTAG|A 5’ 连接后: 5’ GGATCT CCTAGA 5’ 注意: 连接后切割位点序列改变不能被 BamH I 和 Bgl II 酶所识别!! 第五章 分子生物学研究法 后两种连接反应中会出现下列问题: 目的基因片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化； 几个DNA分子串连形成寡聚物； 目的基因与质粒正反两种连接方向(orientation )。 防止酶切后的线性载体分子自身环化作用, 可用碱性磷酸酯酶 处理。该酶可以将载体5’-磷酸基团去除, 留下一个5’-OH基团。 带5’-磷酸基团的目的基因DNA片段可以与去磷酸化的载体相连， 产生一个带有两个缺口的开环分子, 在转入大肠杆菌的受体细胞后在扩增过程中缺口可自行修复。 检查目的基因在质粒载体上的定位方向和是否形成寡聚物, 可用双酶切片段重组法。 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 3.目的基因导入受体细胞 1) 原核生物的人工转化 细菌转化: 是指其细胞捕获游离的DNA, 并使此DNA整合到细菌的 基因组DNA中成为永久遗传组成部分。 第五章 分子生物学研究法