第八章 基因工程技术讲解.ppt

　;;;◆基因工程相关概念 ◆基因工程相关的酶学 ◆基因工程的载体 ◆目的基因的制备和分离方法 ◆载体与目的基因的连接 ◆重组体的鉴定与分析 ◆隆基因的表达;重组DNA技术的发展史;　;;; 细胞的分化潜能 ;细胞核全能性;;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ; DNA克隆目的: ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA; ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。;　;基因工程的基本过程和工作原理;; 在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。;　;工具酶;一、 限制性核酸内切酶1.1 概念;;1. 限制性核酸内切酶;　;　;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶; 同裂酶（isoschizomer ），是来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。  同尾酶（isocaudarner），一类识别不同核苷酸序列但能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。同尾酶产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。如Sal I 与Xho I，BamH I与Bgl II。 ;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶; 二、DNA连接酶定义：可以催化具有5’-磷酰基和3’羟基末端形成磷酸二酯酶键的酶。; 二、DNA连接酶;二、 DNA连接酶;二、 DNA连接酶;三、聚合酶;1. DNA聚合酶 I 大片段 (Klenow片段);在模板??引物 (DNA或RNA) 存在的条件下，以dNTP作底物，沿5→3方向合成与模板互补的DNA。 能够用于M13双脱氧法测序。 ;单链特异性的3→5外切核酸酶活性 ;修补经限制性酶消化dsDNA得到的3’隐蔽末端，使其成为平头末端。 ?使用随机引物进行DNA标记 在cDNA的克隆中用于cDNA第二链的合成 双脱氧法DNA序列测定 (Sanger法)。 ;;;1.来源 源于T4噬菌体感染的E.coli。 2. 酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段 （1）5ˊ→3ˊ 聚合活性 （2）3ˊ→5ˊ 外切酶活性（T4 pol/Klenow） 3.基因工程中用途与Klenow片段一致（参前，标记末端，填平5’末端），不同的是可对3’突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，产生3’凹端。 ;T4-DNA聚合酶;T4-DNA聚合酶;3.TaqDNA聚合酶(Taq DNA pol，Taq pol） 该酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依赖5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最适反应温度是75℃－80℃,37℃ 活性有10％。 该酶的主要用途是进行PCR反应（详参聚合酶链，polymerase chain reaction） ;逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性：;;一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。 用途： 催化DNA的3末端添加同聚物 DNA的3‘末端标记 给载体或cDNA加上互补的同聚尾，造成人工粘液末端可以重组。 ;能催化除去DNA的5′磷酸基团，5’-P变为5’-OH； 处理后的DNA片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端，因此它们不能进行自连接。可以在克隆时降低载体DNA的背景。 小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal ， CIP) 和细菌碱性磷酸酶（ba