第八章讲 基因工程 2.ppt

第八章基因工程及其在医药工业中的应用 ;第四节 目的基因制备和常用分离方法 ;（二）聚合酶链反应（PCR）P333图8-16 1、定义： 又称基因体外扩增；是在引物的介导下，通过变性、退火、延伸三步循环反应，体外快速的DNA特异性扩增技术。;;; 5’;2、PCR反应原理;;;;3、PCR产物特异性;4、PCR反应体系;5、PCR的主要用途;PCR仪器设备：;二、未知基因获得;基因文库（gene library）(G-文库)：是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。 基因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列。 每一个克隆只含有一个基因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。 ; （二） cDNA文库 将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为 cDNA文库。;cDNA文库(C-文库)：是以mRNA合成的互补cDNA的随机片段的重组DNA克隆群。 cDNA文库不含内含子序列，易于表达。 具有组织细胞特异性：不同组织细胞、不同发育阶段，基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态； C-文库比G-文库小得多，更容易筛选。;第五节 载体DNA与目的基因的连接 ; DNA分子的体外重组过程示意图;一、黏性末端DNA片断的连接：; 同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接 ;1 、插入失活法（单酶切）; 插入失活示意图;2、定向克隆法（双酶切） ; 双酶切DNA片段粘性末端的连接 ;3、载体5’端脱磷法 ;二、平末端DNA片断的连接：;2、同聚物尾连接：P343图8－23 利用末端转移酶在载体和目的基因的3’OH上加上互补的同聚物尾，两者重组后，空隙由DNA聚合酶Ⅰ填补。 ;加入同聚体尾（homopolymeric tail）连接;3、人工接头法：P343图8－24 ; 连接物分子连接平末端的DNA片段示意图;第六节 重组分子引入受体细胞 ;;二、受体细胞的类型;三、受体细胞的感受态;四、重组子导入细胞的方法;转化（transformation）; 重组DNA转化过程示意图;转染（fection） ;显微注射法 ;第七节 重组体的鉴定和分析 ;一、生物学方法;2、β－半乳糖苷酶筛选法 a –互补（ a- complementation） 某些质粒（如PUC系列），含有大肠杆菌的lacZ基因片段，在该基因区又有MCS，这些质粒将导入 lacZ- 的宿主菌中表达。 如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β –半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blue clony。 如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生β –半乳糖苷酶，产生white clony。 ;a –互补筛选重组体示意图;3、营养标记筛选法 例如酵母人工染色体上的TRP1H URA3基因，分别是酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型trp1-和ura3-的野生型等位基因，在相应的缺陷型酵母细胞中作为选择标记；;（二）噬菌斑形成筛选法：含有外源基因的噬菌体载体可以形成噬菌斑，反之不能。 （三）遗传互补法——利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 利用表达产物与宿主细胞中营养缺陷突变发生互补。 （四）利用报告基因筛选植物转化细胞 ;二、核酸分子杂交：;三、免疫学方法; 四、PCR技术 ; 五、酶切鉴定;六、序列分析－双脱氧终止法测序（Sanger法）;2、引入双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于其3ˊ位又少了个羟基。其5 ’Pi可以和多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但3’不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止于ddNTP。 ;3、如果在DNA的合成反应中，在4种正常的dNTP之外，再加入一种少量的ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列长短不一的核苷酸链。;4、在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别终止于每一个A、G、C、T的位置上。对这4组核苷酸链同时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列;序列测定; 第八节 克隆基因的表达;二、克隆基因在大肠杆菌中的表达; （二）构建策略： 一）目的基因：表达真核基因必须克隆cDNA片段,表达分泌蛋白必须去除真核信号肽序列,ATG的5’端非编码区必须去除 二）载体选择：必须是大