第八章讲 基因工程与体外表达.ppt

（二）cDNA文库 将某一时间某一种类细胞中所有的cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为cDNA文库。 （三） PCR扩增特定基因 TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中 。 四、人工化学合成 二、载体的选择与制备 λ噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库，pUC系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的DNA片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基因是要表达的，则要选择合适的表达载体。 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 粘性末端连接 三、DNA分子的体外连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 平端连接 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 适用于： 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 同聚物加尾连接 四、将重组体DNA分子导入宿主细胞 1、转化 指将质粒或其它外源DNA导入感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 2、感染 以λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当细胞，并在细胞内扩增。 3、转染 指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 转染方法： 1、磷酸钙共沉淀法 2、电穿孔法 3、DEAE-葡聚糖法 4、脂质体介导基因转染 5、显微注射法 五、目的基因的筛选与鉴定 1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (插入失活法) 抗药性标记选择 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 若克隆基因的表达产物与宿主菌的营养缺陷互补,那么就可以利用营养突变菌株进行筛选,这就是标志补救. α 互补的检测 目 录 2、免疫学方法 利用特异性抗体检测表达产物 鸡的β肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法 原位杂交 目 录 3、核酸杂交法筛选特定DNA Southern印迹 目 录 第八章 基因工程与体外表达 克隆（clone） 无性繁殖 基因克隆(DNA重组、 DNA克隆、分子克隆):应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。 基因重组示意图 基因工程：为实现基因克隆所采用的方法及其相关的工作。 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 常用的工具酶： 第一节 基因工程的工具酶 一、限制性核酸内切酶 一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶 特异核苷酸序列 ：  大多为 4~6 bp  回文对称（palindrome sequence） 5’GAATTC 3’ 5’GGATCC 3’3’CTTAAG 5’ 3’CCTAGG 5’ 1.分类： 根据酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅