第十章 重组DNA技术讲解.ppt

重组DNA技术 ;第 一 节自然界的DNA的重组 DNA Recombination;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 ;Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 ; 内切酶 (recBCD);片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。;Holiday中间体;（一）接合作用;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;;第 二 节 基因工程;重组DNA技术的发展史;相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系;一、重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 也称基因克隆或重组DNA 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶;作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。;（三）目的基因;（四）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆???体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;1. 质粒 (plasmid);;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;M13噬菌体pUC系列的物理图谱;3. 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;* 1、化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;（二）克隆载体的选择和构建;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;Bam HⅠ;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件 安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造） 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态;（五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等;(插入失活法) 抗药性标记选择;α互补; α 互补的检测 ;原位杂交;Southern印迹;鸡的β肌球蛋白的克隆和检出;重组DNA技术操作过程可形象归纳为 ;重组DNA技术操作的主要步骤;表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化;1.