第十章讲 外源基因表达与基因工程药物.ppt

第十章 外源基因表达与基因工程药物 DNA Recombination Technology;DNA克隆、测序与重组技术的历史;重组DNA技术的发展史;重组DNA技术;一、重组DNA技术相关概念;技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) ;与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。;第一个字母??自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;;二、DNA连接酶 三、DNA聚合酶 四、修饰酶 1、末端转移酶 2、碱性磷酸酶 3、T4多核苷酸激酶 4、DNA甲基化酶;目的基因(target gene) ;基 因 载 体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。;载 体 的 选 择 标 准;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;质粒 (plasmid);质粒载体分类;pBR322载体特点;pUC系列载体特点; λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;粘性质粒(cosmid); 粘 性 质 粒 也称柯斯载体。是带有粘性末端位 点的质粒, 柯斯质粒是人工建造的的含有 λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊 类型的质粒载体。 ;粘 性 质 粒;粘 性 质 粒; 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;;mRNA ;（二）克隆载体的选择和构建;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;平端连接 ;目的基因;在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ;转 化 作 用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;转 导 作 用;常 用 转 化 方 法;1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等;(插入失活法) 抗药性标记选择; α互补; 原 位 杂 交; Southern印迹;鸡的β肌球蛋白的克隆和检出;重组DNA技术操作过程可形象归纳为： ;重组DNA技术操作的主要步骤;第 四 节;表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化; 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表