第四军医大分子生物学 基因工程演示教学.pptx

一、重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;重组DNA技术中常用的工具酶;分子克隆实验指南—冷泉港实验室;5’---A-G-C-T-A-G-A-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型;第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 ;第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。;第三类（ III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。;;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。;/products/restriction-endonucleases;酶的活性：在适当反应条件下（温度，pH，离子强度），1小时内完全降解1μg λ 噬菌体DNA中所有同一限制内切酶位点所需的酶量定义为1个活性单位。 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度（蛋白质，酚，氯仿，乙醇，SDS，高盐浓度）； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 缓冲液的 pH值。;限制性核酸内切酶; 反应体系（15uL）： 质粒DNA 6uL 酶1 0.5uL 酶2 0.5uL Buffer 1.5uL H2O 6.5uL ;DNA连接酶（DNA Ligase）;T4 DNA Ligase?， 10 × T4 DNA Ligase Buffer;DNA聚合酶;（二）Klenow聚合酶Klenow fragment ;（三）热稳定DNA聚合酶;;;;cDNA文库概述; 3）器官特异性 有的结构基因的表达就有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。 4）代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。;相对于基因组文库而言，cDNA文库有优点;不足之处;;; For the ?improvement of the?polymerase chain reaction?(PCR) technique,;引物 dNTP 模板DNA 耐高温 DNA聚合酶;“PCR仅仅是实验中的一个小技巧，虽然其中的知识和智慧含量似乎并不丰富，但是毕竟没有人更早的发明它。它对分子生物学的影响远远超过了其他所有的技术”;;;1.质粒 DNA;pBR322;λ噬菌体DNA改造系统 （允许插入的外源片段远远超过质粒，感染能力也大于质粒转化细菌的能力，所以一直作为基因组文库和cDNA文库的克隆载体） λgt系列（插入型，允许插入6-8kb，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，允许插