菌种选育方法技巧.ppt

2 质粒DNA的提取 从含pETBlue-2(或pET21a)质粒的K12菌株提取 3 DNA重组－限制性酶切和连接 酶 切 370C酶解3小时 酶 切 反 应 体 系（ 20 uL ） 管号 核酸 10xbufferK ddH2O BamHI HandIII tube1 目的基因 AKP 16 uL 2 uL 0 uL 1 uL 1 uL tube2 10 uL pETBlue-2 or pET-21a 2 uL 6 uL 1 uL 1 uL 酶切片段的回收 PCR产物快速胶回收试剂盒 连 接 连 接 反 应 体 系（ 20 uL ） 目的基因AKP 载体 pETBlue-2 or pET-21a 10 x Ligase buffer ddH2O T4DNA连接酶 12 uL X uL 2 uL Y uL 1 uL 140C连接过夜。 －200C保存，用于转化受体细胞。 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 感受态（Competence)： NovaBlue是一种适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株，细菌处于容易吸收外源DNA的状态 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程 致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物 复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落 转化的确切机制还不清楚 重组子筛选-蓝白筛选 DNA重组－重组子的筛选及表达菌株的转化 重组质粒的提取 表达菌株感受态细胞的制备 转化及复苏 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 SDS－PAGE 免疫分析 ＋ NC 膜 滤纸 凝 胶 培养 细胞破碎 蛋白分离 转膜 免疫分析 工程菌的稳定性问题 由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原、人促红细胞生成素(EPO)、重组激酶、集落刺激因子GM-CSF等，成本大大下降 研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌稳定性的解决已日益受到重视，并成为基因工程这一高技术成就转变为生产力的关键之一。 工程菌不稳定性的表现(倾向) 工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。 质粒的丢失； 由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率往往小于不含重组质粒的比生长速率，即宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。 重组质粒发生DNA片段脱落； 表达产物不稳定。 工程菌不稳定性的原因 工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等因素有关。 质粒本身的分子结构：引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定 宿主：除上述质粒中有同源序列外，还与宿主的比生长速率、宿主中重组基因(rec系统)的完整性、重组时有关基因的具体变异等都有关系。 培养环境：高温、去垢剂(如SDS等)、某些药物(如利福平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。 防止或降低工程菌的不稳定性 (1)组建合适载体 在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。 (2)选择适当宿主 重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响，住选择宿主时，必须确定其遗传特点。相对而言重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。 (3)施加选择压力 在重组DNA技术中，有好几个方面利用选择压力，如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株，而在利用克隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。 施加选择压力 A 抗生素添加法 通常在重组质粒上含有抗药性基因。在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。 B．抗生素依赖变异法 即通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖性突变株，只有存该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。 C．营养缺陷型法 与上述抗生素依赖变异法相类似。其原理是通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入到重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。 防止或