讲稿 第24章 重组DNA技术讲解2011.6.ppt

重组DNA技术 Recombinant DNA Technology; 又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因克隆（gene cloning) 技术，是指在体外利用酶学方法将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。 ; 克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。因此，重组DNA技术又称为基因工程技术。 ;技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆(DNA cloning) 细胞克隆 器官（或组织）克隆 个体克隆（动物或植物）　; ;个体克隆：克隆羊多利的诞生;从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素的基因，然后注入到玫瑰中;基因重组法选育高产彩色茧蚕的品种;重组DNA技术基本原理;第 一 节 重组DNA技术中常用的 工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology;限制性核酸内切酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 反转录酶 末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶） DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶I大片段 Taq DNA聚合酶 多核苷酸激酶 ;GGATCC CCTAGG;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;（二）Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性;2.限制性核酸内切酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;Bam HⅠ;GGATCC CCTAGG;不能切割在识别位点内有特异碱基甲基 化的序列 2. 缓冲液PH 3. 环境温度;二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接;;三、重组DNA 技术中还需使用其他常用工具酶;（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团 ;（二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA; ;大肠杆菌DNA聚合酶I具有： 5′→3′聚合酶活性 3′→5′ 5′→3′;5′ A G C T T C A G G A T A ? 3′ | | | | | | | | | | |;小片段;Klenow片段的主要用途有： ① 补齐双链DNA的3′末端，使其转变成平端； 或通过补齐3′端而使3′末端标记； ② 在cDNA克隆中，用于第二???链的合成； ③ 用于DNA序列分析。;将黏端转变成平端;将黏端转变成平端;（六）Taq DNA聚合酶常用于PCR（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5′羟基 末端磷酸化;重组DNA技术中常用的工具酶;第二节 目的DNA的获取 Preparation of Interested DNA;目的基因获取的方法：;一、化学合成法可直接合成目的DNA? ; 第一步：构建基因组DNA文库 （ DNA文库指包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息。 ） 第二步：筛选含有目的基因的克隆。 ;组织或细胞染色体DNA;第一步：构建cDNA文库 （包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存了全部的基因表达信息。 ） 第二步：筛选含有目的cDNA的克隆。 ;;基因组DNA文库和cDNA文库的构建;菌落或噬斑原位杂交 2. 针对表达文库，可用抗原-抗体或配体-受 体结合的原理（亲和筛选法）筛选;;AAAAAA; 已知目的基因序列，从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，用PCR反应获取目的DNA 。 ;五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA;1.酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用 2. 酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定/分离新的相互作用蛋白及其编码基因 ;酵母双杂交系统原理;A. 无转录因子：报告基因不表达;酵母单杂交技术（yeast one-hybrid）由J. Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来 是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法； 通过对酵母细胞内报告基因表达状况