年产300吨螺旋霉素的发酵工艺设计_精品.doc

1绪论 1.1引言 螺旋霉素，英文名Spiramycin。白色或微黄色粉末，微有味；微吸湿；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，难溶于水。该品系多组分大环内酯类抗生素，具有强大的体内抗菌作用和抗菌后效应（PAE），能够增强吞噬细胞的吞噬作用，广泛分布于体内。本品在组织细胞内浓度较红霉素高，而副作用小于红霉素。与红霉素有交叉耐药。对革兰阳性菌和一些革兰阴性菌如链球菌、脑膜炎双球菌、百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌等包括对青霉素、链霉素、四环素、氯霉素耐药菌均有效。 螺旋霉素是多组分的抗生素，其主要成分包括螺旋霉素I、II、III。其发酵液中组分I含量最高，为60％；其次是组分II含量，为24％；最后是组分III含量，为13％。各组分活性相近。螺旋霉素是3种组分的复合物，复合物为奶油色、味苦的无定形碱性抗生素。可溶于氯仿、醇类、己烷、苯、酮、醋酸酯，微溶于水。其硫酸盐溶于水和低级醇。熔点：组分I为134～137℃：组分II为130～133℃；组分III为128～131℃。在231-232 um处有紫外吸收峰，本身带有发色基团。遇浓硫酸或盐酸呈紫色反应。麦芽酚反应、茚三酮反应、坂口反应、双缩反应、斐林反应均为阴性。 多年来，在我国药品市场中，抗感染药物的销售额始终位居第1，目前年销售额已达400多亿元人民币，占全国年药品销售总额的30%左右。在抗感染药物市场中，大环内酯类抗生素是主力军之一，在今后的发展中，我国的医疗保障系统将会更完善，对螺旋霉素及其衍生物的需求也会加大。 2.菌种的选育 2.1出发菌种的选择 一般菌种分离纯化和筛选的步骤如下： 第 1 页 用产二素链霉菌SIPI9004生产螺旋霉素。 2.2筛选培养基和培养条件 琼脂培养基/%：葡萄糖1.5，黄豆饼粉1.0，麸皮1.0，MgSO4?7H2O0.05，CaCO30.3，琼脂2.0；pH7.0，28℃培养12d。 种子培养基：葡萄糖，淀粉，黄豆饼粉，酵母粉，NaCl，CaCO3；pH7.0，斜面孢子挖块接种，摇瓶置于旋转摇床(230r/min)，28℃培养48h。 发酵培养基：淀粉，鱼粉，酵母粉，NaCl，NaNO3，KH2PO4，CaCO3；pH6.5，取种子培养液10%移种于发酵摇瓶中，摇床(230r/min)，28℃培养120h。 2.3测定方法 总糖：用费林法测定。菌体浓度：取发酵液10ml置于刻度离心管中，离心(3000rmin)10min，测定菌丝体湿重。发酵单位：取发酵滤液用杯碟法测定，藤黄八叠球菌为检定菌。 2.4菌种处理 单孢子悬浮液制备：新鲜孢子斜面加入无菌生理盐水，洗下的孢子经滤纸过滤，镜检单孢子分散度达到97%以上方可用于诱变处理。 2.5菌种诱变 吸取单孢子悬浮液6ml培养皿，置于30W的UV灯(253.7nm)下30cm处，振动照射处理，杀死率控制在90%左右。 2.6 初筛 用氨基乙酸和缬氨酸作为筛选剂，以适当浓度分别加至琼脂培养基中，制成不含药物平板及药物浓度梯度平板。将诱变后存活孢子涂布于上述平板上，恒温培养；UV处理的和不处理的孢子，分别涂布于不含药物的琼脂培养基平板上培养作对照。分别选取单菌落传斜面培养。 第 2 页 2.7摇瓶复筛 斜面挖块移种种子瓶培养；以10%接种量移种发酵瓶发酵培养，发酵滤液作生物效价测定，去劣留优。 2.8高产菌株 高产菌株为突变的产二素链霉菌SIPI9004生产螺旋霉素。 3菌种保藏 菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法、液氮超低温保藏法。 真空冷冻干燥法：是目前比较理想的一种方法。在低温-15°C下，快速将细胞冻结，并保持细胞完整，然后在真空中使水分升华至干。在此环境下，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，故可长时间保存，一般为5-10年，最多可达15年之久。此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的设备。 产二素链霉菌遗传极不稳定，在培养过程或菌株保藏中，常发生变异，故采用真空冷冻干燥法。 4培养基的配置 4.1配制培养基的原则 培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上①满足必须的原料；②生化反应的基本条件（温度、溶氧和批pH）；③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；④培养基成分不影响下游产品的提取加工。 4.2培养基类型 培养基可以按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。 4.2.1孢子培养基 孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基。 第 3 页 4.2.2种子培养基 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。 4.2.3发酵培养基 发酵培养基既要有利于生