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实验室方法全集 实验室方法全集 1 1 Western Blot Protocol 2 2 RT-PCR 的实验过程 7 3 细胞的冻存、复苏、传代和计数 9 4 外周血中提取DNA 12 5 组织中提取DNA 13 6 小鼠髓源性树突状细胞的提取和培养 14 7 细胞组织样品 15 8 原代培养人HSCs的表型确定 18 9 ELISA操作步骤： 18 10 鼠尾胶原制备方法 19 11 QIAEX II 试剂盒提取琼脂糖凝胶电泳DNA方法 20 12 Ltn重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定及鉴定 20 13 狭缝印迹杂交 23 14 细胞核蛋白提取步骤： 27 15 EC were treated with IFN-γ(1000u/ml) for 72h to induce MHC class II. 29 Western Blot Protocol 样品处理 1．培养细胞： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵ 胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗2～3次。 ⑶ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上30～60min。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸ 取少量上清进行定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer（终浓度为1×）后，100℃，5～10min变性，低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天。 2．组织： ⑴ 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g离心，4℃，2min。 ⑶ 取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer（终浓度为1×）后，100℃，5～10min变性，低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天。 配胶 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 各种不同浓度的胶配方见下表： 分离胶(10ml) 8％胶 12%胶 15%胶 积层胶(5ml) 5％胶 H2O 4.6 ml 3.3 2.3 H2O 3.4 30%丙烯酰胺 2.7 ml 4.0 5.0 30%丙烯酰胺 0.83 1.5M Tris (pH8.8) 2.5 ml 2.5 2.5 1.0M Tris (pH6.8) 0.63 10% SDS 0.1 ml 0.1 0.1 10% SDS 0.05 10% APS 0.1 ml 0.1 0.1 10% APS 0.05 TEMED 0.006 ml 0.004 0.004 TEMED 0.005 1.5M Tris (pH8.8): 98ml 水+Tris+2ml盐酸+微调 1.0M Tris (pH6.8)：94ml 水+Tris+6ml盐酸+微调 丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（kD） 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～ 封胶： 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，一般可用ddH2O，待分离胶凝固后，将ddH2O倒掉。 4．灌好积层胶后，约30～60min后小心拔除梳子、以免上样孔变形。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 电泳 1．上样前将胶板下的气泡赶走。 2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。 2．跑积层胶时以100V进行稳压电泳，跑分离胶时改为200V进行稳压电泳。 3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。 转膜 1． 浸泡硝酸纤维素膜：将膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。 2．将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），右下切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧2张滤纸，注意用玻棒逐出气泡。 3．转膜： 湿转：转膜槽用去离子水淋洗晾干，加入1000ml转膜液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。将电泳槽置于冰水混合物中冷却。恒流200mA1～3h（不同大小蛋白转膜时间不同）。 封闭及杂交 1．封闭： 将膜从转膜槽中取出， TBS-T稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢