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生物化学实验 ——PCR实验（聚合酶链反应） PCR原理 PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，是在短时间内大量扩增特定DNA片段的技术。 PCR的起始材料是一个基因或片段的DNA模版，双链DNA分子的互补链经加热后解开，形成单链；引物（两条合成短单链DNA，分别与模版DNA的特定序列互补）与互补序列相结合；四种三磷酸脱氧核苷酸（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）存在时，聚合酶从引物处从5至3`端合成互补链。多次循环后，模版DNA序列的含量大大增加，用于研究分析。 PCR过程 1. 变性(denaturation)：一般在92～96℃。模板及新合成的双链DNA都变性成为单链，该步骤一般只需30s～lmin。 2. 退火(annealing)：一般在37～65℃。引物特异地结合到变性后的单链DNA上。这一步骤一般需30s～lmin。 3. 延伸(extension)：温度一般为72℃，时间为1～2min。DNA聚合酶根据模板的顺序，在引物3’端接上一个三磷酸脱氧核苷酸，从而使新合成的互补链不断延伸。PCR产物一般为几百个碱基对(bp)，长的可达几十千个碱基对(kb)。如果需要合成长片段则可适当延长时间。 上述3步骤为1个PCR循环，DNA片段就增加1倍。反复循环反应，DNA分子数呈指数增长，即2n(n为循环次数)。 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳 原　理 不同大小和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等）有不同的迁移率，可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此分析实验结果。 操作步骤 （一）凝胶制备 琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧杯中，加入100ml 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，至琼脂糖完全溶解，冷却至70℃左右时加入溴化乙锭（10mg/ml）5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入凝胶成形模具，室温下待凝胶完全凝固。 （二）上样电泳 将凝胶板放入电泳槽中，在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。PCR产物管中加入上样缓冲液，混匀后用加样器加入凝胶样品孔中。接通电源，调节电压至50~100伏，电泳45分钟。 （三）观察结果 电泳后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察。 仪器与器材 1、电泳仪 2、水平式核酸电泳槽 3、紫外凝胶成像仪 试剂与材料 1、琼脂糖 2、6×点样缓冲渡：0.25%溴酚兰、40%蔗糖 3、DNA分子量标准：λDNA分子量标准：λDNA/HindⅢ 4、50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：（50×）每升 242g Tris 57.1ml 冰醋酸 100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 5、0.8%琼脂糖：0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解 6、10mg/ml EB 　1.0g 溴乙锭 　　100ml 三蒸水 PCR结果 PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化 PCR虽然为一个简单的实验，但在实际过程中可能会出现各种问题。产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作，试剂质量，PCR反应过程中各种试剂的含量，以及反应条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论，大家遇到问题后可以对号入座的查一下。当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除，并不断的摸索才能彻底解决。 假阴性，不出现扩增条带 　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有