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层析理论及技术 实验目的 学习层析法原理； 学习纸层析的原理并纸层析分离氨基酸； 学习凝胶过滤的原理 实验原理 层析（chromatography） 利用待分离物质中不同组份的理化性质的差异（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分子解离度），使各组分在支持物上集中分布于不同部位，从而得以分离的方法。层析均由固定相和流动相组成，当待分离物质混合物随流动相通过固定相时，在两相之间进行再分配，通过部分收集和检测，达到分离各组份的目的。 固定相：位置固定不动，并阻止所分离的组分的向前移动（阻力）； 流动相：对固定相作单向运动，并带动所分离的组分的向前移动（动力）； 层析的分类 根据两相所处状态： 气相(气-液;气-固)层析;液相(液-液;液-固)层析 根据层析分离机制： 吸附层析； 分配层析； 离子交换层析； 凝胶层析； 亲和层析; 根据操作形式不同： 柱层析；薄层层析；纸层析；薄膜层析; 氨基酸的纸层析 将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、 展开、定性、和定量的液-液分配层析法。 固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：液-液分配层析 Kd(分配系数)与温度、溶质及溶剂的性质有关。 Rf值测量示意图 L0 注意事项 保持层析纸干净,勿用手直接接触,否则污染层析结果 控制样品点直径不大于0.2cm 层析缸保持密闭 2. 凝胶过滤层析法 试验原理 操作 装柱；平衡； 上样； 洗脱和检测； 层析柱的再平衡； 凝胶及凝胶柱的选择 根据不同分子量选择不同凝胶 Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值 X 10 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 凝胶柱的选择 凝胶的前处理 上柱、洗脱、收集 凝胶的再生及保存 再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷 凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白(示教) Sephadex G-50凝胶柱及样品准备 上样 洗脱 观察红色的色带(分子量大的血红蛋白)先洗脱下来,黄色的色带(分子量小的DNP-鱼精蛋白)后洗脱下来 注意勿搅动床面,避免干柱 3. 离子交换层析法原理 * ? ? ? 茚三酮显色法原理 茚三酮显色法原理ninhydrin reacts with amino acids to produce a blue-purple color (yellow in the case of proline), making the amino acids spots visible for analysis. L1 L2 讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留,Rf 小(流动相极性↑, Rf↑） 非极性组分→易流出, Rf大(流动相极性↑,Rf↓) Rf是Kd的表观体现。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 应用 分离蛋白质 脱盐 蛋白质分子量的测定 Kd=(Ve-Vo)/Vi 溶质的分配系数 溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。 碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。 将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。 装柱 如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。 载体 阴离子交换层析 *