免疫组化需要注意事项.pdf

免疫组化需注意的问题 一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 为达到免疫组织化学染色的要 ，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开， 早取材，早固定。 二、组织脱水必须彻底干净 组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱 水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天 不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪 费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、 外观好看，还要求适中。 三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折 应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡， 无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染 色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一， 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时， 由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹 折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。 四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。 免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看 起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新 出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不 利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经 自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片 浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyltriethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙 酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。 五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于 破坏抗原。 应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液 的沸腾且需持续十几分钟，PBS 的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此， 对切片的质量要求很高，尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60 分钟即可按此进行结果是切片掉片严重，切片松动率占 100%。切片究竟烘烤多长时间才合 适，既不脱片和适合各项要求，又不至于破坏抗原。几组实验［］诊断P173认为，切片在 60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一 般使用的石蜡，其熔点在60℃左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在65℃左右， 组织在这样温度中要浸泡2小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃ 的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴 牢固，抗原保存好，染色成功率达100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。 特需要注意的是，不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片，烘烤后应尽快进行染色。如 上海笃玛生物科技有限公司 果切片切完后，迟迟不进行染色，存放于室温中或工作冰箱中，切片中的抗原将会随着时间 的延长而逐渐消失，甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片，即行染色，染多少张切多少张， 这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。 六、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。 蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间， 才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀， 阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻 底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的 青睐。脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高， 脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡 试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。总之，操作时应根据不同的季节， 不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底，干净，完全地脱去切片上 的蜡。为了做到这一步，切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要 。比如：当天切的切 片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预