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液相色谱教程 (四)液相色谱柱基础知识 Waters 中国有限公司培训中心 液相色谱柱基础知识(3) Waters 中国有限公司培训中心 液相色谱柱与分离机理的关系 从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受 从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合 对HPLC色谱柱的要求(1) 合适的选择性 满足不同的分离要求 良好的色谱峰形 重现性 宽应用范围 硅胶基质C18填料都相同吗？ 色谱实验结果揭示： 疏水性不同 残留硅羟基活性不同 为什么？ 不同 C18配体键合水平（状况） 配体覆盖率 不同硅胶颗粒基质 密度，表面积，孔径 纯度 色谱柱品牌名称 不同色谱柱 “品牌名称” 表示不同的硅胶基质 Waters Symmetry? C18 Waters Nova-Pak? C18 相同的 “品牌名称” ,不同的配体表示相同的硅胶基质，键合相不同 Waters Symmetry? C18 Waters Symmetry? C8 配体不同的影响：C18与C4 品牌不同的影响: (相同配体) C18键合相硅胶柱填料需要 合适的湿润度 什么是“疏水塌陷”？ Symmetry? C8：疏水塌陷 SymmetryShield? RP8：无疏水塌陷现象发生 带有极性基团的反相色谱填料 内嵌极性基团配体:可能机理 水表面层机理 相同硅胶基质(配体不同) 选择性不同 对HPLC色谱柱的要求(2) 合适的选择性 良好的色谱峰形 定量精度、灵敏度与分离度 重现性 宽应用范围 色谱峰对称性的衡量方法 对称峰形的益处 更准确与精确的定量结果 纯度分析 稳定性分析 更高的灵敏度 更好的检出限与定量限（LOD 和LOQ） 对低浓度杂质有更强的检测能力 更好的分离度 更有利于相邻色谱峰的分离 由于拖尾引起的积分误差 由于拖尾引起的灵敏度差异 峰形对分离度的影响 不同填料的峰形比较 具有良好峰形的Symmetry柱 建立高效液相色谱柱的新标准，开创新一代高品质色谱柱 全新的标准： 在很宽的pH范围下，对酸、碱及中性化合物均有非常好的色谱峰形 极高的批间重现性 独特的选择性 良好的柱寿命 对HPLC色谱柱的要求(3) 合适的选择性 良好的色谱峰形 重现性 色谱柱间重现性 批次间重现性 宽应用范围 色谱柱重现性的重要性 重现性是液相色谱分析的基本要求 缺乏重现性是用户最担心的问题 加快方法验证(Validation)的速度 更容易传递方法 色谱系统之间以及实验室之间 确保长期符合认证及系统适应性等要求 更容易符合法规要求 柱间重现性与批次间重现性的区别 同一批次合成的填料—色谱柱之间的重现性 柱床填充质量控制 塔板数 色谱峰对称性 反压 无选择性差异 不同批次合成的填料—色谱柱批次间重现性 颗粒的物理性质 表面之化学性质 Symmetry —优异的重现性 不同产品批号间的差别最低，充分满足各种严格的cGMP要求 孔径 RSD = 3% 渗透性 RSD = 2% 特征表面积 RSD = 2% 平均颗粒度 RSD = 2% 不同批次间重现性 不同批次间重现性 Symmetry?色谱柱优点 优异的色谱峰形 无可比拟的重现性 所认证的方法置信度高 容易达到法规要求 认证方法的长期稳定性 有利于长期符合法规要求 对HPLC色谱柱的要求(4) 合适的选择性 良好的色谱峰形 重现性 宽应用范围 pH 范围 温度范围 pH对填料稳定性的影响 高pH实验 pH 8时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效 由于填料颗粒溶解,色谱柱内产生空隙 随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长 低pH实验 pH 2时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效 由于键合相之水解作用,被测物丧失保留行为 使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性 XTerra 色谱填料 XTerra?色谱柱 灵敏度与选择性的改变 简化方法开发过程 XTerra?填料：高温稳定性 Xterra :高温寿命试验 Xterra色谱柱的优点 XTerra色谱柱为方法开发提供了极其有效且方便的工具 宽pH范围 良好色谱峰形 高稳定性 高速度 必威体育精装版研制的Atlantis反相柱 新型AtlantisTM 填料的性质 提高极性物质保留能力的同时，改善常规反相色谱性能 双官能团键合C18 (dC18) 端基封口 平均孔径为100 ? 颗粒度： 3, 5 及10?m 　 新型AtlantisTM 填料的特点 对极性与非极性化合物的优异保留特性 在100％水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定 峰形优异 超低键合相流失，质谱兼容 酸性条件下稳定性良好 双键键合C18 ，使之： 具有较长的色谱柱寿命 低pH条件下稳定性增强 极佳的色谱柱间重现性 同时分离极性与非极性化合物 极性