刘建宇-生化分析02.pptVIP

第二章 电泳法（1） 电泳现象： 在盛有红褐色Fe(OH)3胶体U形管的两个管口，各插入一个电极。接通两个电极间的直流电源，会观察到阴极附近红褐色逐渐变深，阳极附近红褐色逐渐变浅的现象，表明带正电荷胶体粒子在电场作用下向阴极移动，这就是电泳现象。 第2章 电泳法（2） 电泳法：利用在相同电场力下，待分离样品中各种分子的带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、检测或提纯的技术。 生物化学家蒂塞利乌斯 蒂塞利乌斯（ Arne Wilhelm Kaurin Tiselius ）1925年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究。曾自制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状，并与斯韦德贝里合作发表了第一篇论文，报道了测定蛋白质淌度的新方法。1930年他进一步改进实验手段和装置，发表了关于色谱法和吸附的论文。1935年改建原有电泳装置，发展了区带电泳法，大大提高了效率和分辨率。1940他用自己设计的新电泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4个组分，分别命名为：白蛋白?、?、?和球蛋白。该法迅速应用于分离和鉴定各种复杂蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。 因对电泳分析和吸附方法的研究，特别是发现了血清蛋白的组 分而获得1948年诺贝尔化学奖。 第2章 电泳法（3） 按原理分类： 区带电泳、移动界面电泳、等速电泳、等点聚焦电泳 按载体分类： 载体电泳：凝胶电泳、纸电泳、薄层电泳、粉末电泳、聚焦电泳 无载体电泳：毛细管电泳、自由电泳 按载体装置形式分类： 平板式电泳、垂直板式电泳、垂直柱式电泳 按pH的连续性不同分类： 连续pH电泳（整个电泳过程pH保持不变）、非连续pH电泳 2-1 基本原理（1） 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？ 当带电离子以速度v 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力（FE）和平动摩擦阻力（F）的作用 2-1 基本原理（2） 影响电泳分离的因素 物质本身的结构和性质 荷质比差异越大分离效果越好（电泳迁移率的主要影响因素）；粒子形状也有影响 外部因素 支持介质：天然琼脂糖和聚丙烯酰胺等（选择依据：吸附和电渗要小） 溶液介质：缓冲溶液（关键指标：pH和离子强度0.02~0.2 mol/L） 电场强度：E大可使分析速率加快，抑制扩散，有助于分析，但E过高时必须冷却（500 V以内为常压电泳，不需冷却） 温度：影响重现性 2-2 常规电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 等点聚焦电泳 双向电泳 2-2-1 醋酸纤维素薄膜电泳（1） 以醋酸纤维素薄膜为支持介质的电泳。醋酸纤维素薄膜是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜（CAM）。 2-2-1 醋酸纤维素薄膜电泳（2） 实验操作步骤（1）： 预处理：a. 膜的准备（合适大小；距边缘2 cm划上加样线）；b. 膜片浸泡（置于缓冲液中浸泡完全，用滤纸片吸去多余缓冲液） 加样：用毛细管、微量注射器等在加样线处平稳的前后或左右来回移动加样，样品线条不应超过4 mm；加样体积大小与样品浓度及检测方法关系密切。 电泳：将膜片安放在电泳槽支架上，在电泳槽的电极室内注入适量缓冲液，再用3~4层滤纸做盐桥连接膜片和缓冲液，然后盖上电泳槽，待膜片水平静止10 min后接通电源进行电泳。（需要控制适当时间） 2-2-1 醋酸纤维素薄膜电泳（3） 实验操作步骤（2）： 染色：染色剂不应溶解醋酸纤维素薄膜，可根据样品选择合适染色剂如蛋白质可选择氨基黑10B、丽春红S等。 漂洗/脱色：将薄膜取出移至漂移液中，漂洗若干次至无样品区无色 干燥/透明：干燥可避免膜片卷曲（滤纸、平面重物）；透明化后便于长期保存和光谱扫描（透明液中浸泡，平贴或夹在玻璃板中干燥） 定量：洗脱后测定或直接测定（需专门仪器） 2-2-1 醋酸纤维素薄膜电泳（4） 应用：醋酸纤维素薄膜电泳应用范围较广，可用于检测和分析血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸以及其他生物大分子物质。该法快速简单，是目前在医学和临床生物化学等领域的常规技术。 方法特点：精确性高；快速省时，一般电泳45~60 min即可；灵敏度高，样品用量少；应用面广；膜可长期保存并可用仪器检测；但膜厚度小，样品量少不适合制备。 醋酸纤维素薄膜电泳法分析人血清蛋白 人血清蛋白的pI均小于8.6，在pH8.6的巴比妥缓冲溶液中均带负电荷。以醋酸纤维素薄膜为支持物进行电泳，各种蛋白均向阳极移动，因迁移率不同而被分离。 2-2-2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（1） 原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以丙稀酰胺为单体、亚甲基双丙稀酰胺为交