生物制药技术教学（复旦大学）基因工程制药2.docVIP

基因工程制药 一、概述 基因工程（gene engineering） 又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 技术上三大发明 1、限制性内切酶和连接酶的发现 2、载体（Vector）的发现：载体相当于运送重组DNA分子到宿主细胞的车子 3、逆转录酶的发现，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能 二、基因工程的酶和载体(英文和作用) 1、工具酶(重点) a.限制性内切酶（restriction endonuclease） 定义：能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶 主要存在于原核生物中 生理功能：构成了细胞抵御外源入侵DNA的防御机制 提供了细菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏 分类：I型、II型、III型 II型限制性内切酶 i）异源同工酶：来源不同，识别顺序相同的酶，切割位点不同，产生平头或粘性末端。 ii）同尾酶：来源及识别序列不相同，切割后产生相同的粘性片段。 b.DNA连接酶 定义：催化两条分别具有5’-磷酰基末端与3’-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶。 常用连接酶： i）T4 DNA连接酶：可连接粘性及平头末端 ii）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端 c.DNA多聚酶 i）聚合酶 功能：以DNA或RNA为模板，催化DNA和RNA的体外合成。 特点：需要引物和模板； 不能起始新的DNA链，而是催化dNTP连续加到双链DNA分子引物链3’OH端 不发生从引物模板上解离 *例：大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coli PolymeraseⅠ） 小片段：5’→3’聚合酶活性 大片段（Klenow片段）：双链特异性的5’→3’外切酶活性；单链特异性的3‘-5’外切酶活性 Klenow片段基本用途：补平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；DNA片段的同位素末端标记 ii）Taq DNA聚合酶 功能：耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。在模版及引物存在的条件下，催化与模版互补的脱氧核苷酸一次选择性地连接在引物的3‘OH末端上的反应。 特点： 末端A, 即粘性末端, 5’→3’外切核酸酶活性 有链置换的能力。 无3’→ 5’ 外切核酸酶活性，无校对功能,易突变。 Mg2+依赖酶 用途： DNA序列分析； 应用于聚合酶链反应（PCR）,对DNA分子的特定序列体外扩增(产物为粘末端）； iii）逆转录酶（reverse transcriptase） 功能：依赖于RNA的DNA聚合酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶。有效的转录mRNA成为cDNA，是一个多功能酶。 iv）末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidayl Transferase） 功能：在二价阳离子存在下，催化dNTP沿5‘-3’方向聚合作用逐个顺序加于线性DNA分子的3‘OH末端。 2、载体（Vector） 概念：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因并具有传递运载外源DNA导入宿主细胞能力的DNA片段称为载体。 功能及特征： 运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 应具备的条件： ·具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） ·具有合适的筛选标记 ·具有较高的外源DNA的载装能力 ·具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 ·具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质粒（plasmid） 定义：生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。 分子构型：线性（sscDNA）、环状（OCDNA）、超螺旋 特性： ·质粒的自主复制性 ·质粒具有不相容性 ·质粒具有遗传传递和遗传交换的能力。 ·携带特殊的遗传标记 优点：分子量小易操作；大多有抗性标记；易导入宿主细胞。 缺点：插入外源基因的片段不能太大。 质粒-克隆载体 三个要素： i）复制子：包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。 ii）选择标记：用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞。 iii）多克隆微点（multiple cloning site,MCS）:质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列。 表达载体 应具备的条件： ·载体能够独立的复制 稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存 在于宿主细胞内。 ·强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。 ·应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 ·强的终止子。 ·好的