【doc】脉冲安培检测法测定酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露寡糖.doc

脉冲安培检测法测定酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露寡糖 离子色谱一脉冲安培检测法测定酵母细胞壁 中一葡聚糖和甘露寡糖 李仁勇,梁立娜,牟世芬,蔡亚岐 1(中科院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京,100085) 2(戴安中国有限公司应用研究中心,北京,100085) 摘要建立了高效阴离子交换色谱脉冲安培检测法分离测定酵母细胞壁中t?-葡聚糖和甘露寡糖的方法.以 NaOH为淋洗液,在CarboPacPA10阴离子交换柱上同时分离甘露糖醇,阿拉伯糖,半乳糖,果糖,葡萄糖和甘露 糖.样品中的低聚糖在优化的水解条件下水解得到葡萄糖和甘露糖,通过测定2种单糖的含量而得到8一葡聚糖 和甘露寡糖的含量.这2种单糖即对应低聚糖的检出限(25L进样,S/N一3)分别为0.4和0.5ffg/L,且均具 有较宽的线性范围(O.00250mg/L),3个样品测定的相对标准偏差在0.3～1.0.该方法检测糖简便快 捷,分离效果好,无需衍生,灵敏度高,适用于多种复杂样品中的低聚糖分析. 关键词离子色谱法,脉冲安培检测,酵母细胞壁,B一葡聚糖,甘露寡糖 酵母细胞壁作为一种很有发展前景的新型添加 剂,具有抗生素和益生素双重功效,越来越受到学术 界和养殖业的重视.近年来经过大量研究发现,酵母 细胞壁主要成分是葡聚糖,甘露寡糖,糖蛋白和几丁 质.其中的活性成分葡聚糖和甘露寡糖具有刺激细 胞免疫和体液免疫,促进有益菌生长,抑制有害菌的 作用__1].因此这2种低聚糖的含量成为评价酵母细 胞壁品质好坏的一个衡量标准. 目前常见的低聚糖测定方法有比色法l_3和酶 法_4].只要化合物具备糖结构就能被比色法检测因 此没有选择性.酶法则专一性太强,针对不同低聚糖 需使用相应水解酶,分析耗时长且操作繁琐.而另一 种测定思路则是将低聚糖通过水解得到相应单糖后 再进行检测,最终换算得到相应低聚糖含量.譬如何 国亮等人[5研究的酸水解测定蜂蜜中的低聚木糖,刘 晓永等人_6则分别研究了酿酒酵母中J3一D一葡聚糖 和不溶性葡聚糖.单糖测定方法主要有气相色谱法, 毛细管电泳法,高效液相色谱法和离子色谱法.气相 色谱法]和毛细管电泳法¨9都必须经过衍生后方可 检测,而高效液相色谱法一般可选用示差折光ll1或 蒸发光散射检测器ll检测,虽然无需衍生,但方法的 灵敏度很低,仅适合于常量样品的分析.或者经适当 衍生步骤后再经过紫外和荧光检测1,但对于某些 糖类的检测灵敏度仅略有提高.离子色谱一脉冲安培 第一作者:硕士,助理工程师(蔡亚岐研究员为通讯作者). *国家863重大课题(2007AA06A407)和国家自然科学基金项 目20877O79) 收稿13期:2008—08—20,改回13期:200811—19 检测糖是近年发展起来的新方法,操作简便,无需复 杂样品前处理,更无需衍生,而且具有极高的灵敏度, 通常可以检测到pmol级的糖类物质,因而受到科研 单位和检测机构越来越多的重视.目前的工作还仅 限于测定各种样品中的游离态糖醇,单糖和双糖 ] ,而测定葡聚糖和甘露寡糖等聚糖的研究尚未 见到报道. 本文研究了一种测定酵母细胞壁样品中B一葡聚 糖和甘露寡糖的方法,以硫酸水解得到相应单糖后经 离子色谱柱分离和脉冲安培法检测,最终得到样品中 这2种低聚糖的含量. 1试验部分 1.1仪器和试剂 ICS一3000型离子色谱仪(Dionex,美国):配有 在线脱气单元的四元梯度泵,配备ED3000电化学检 测器,Au工作电极,pH/Ag/AgCl复合参比电极,钛 金属对电极,Chromeleon6.80色谱工作站,AS自动 进样器.Milli—QAdvantageA10超纯水机(Milli— pore,美国).OnGuardIIRP固相萃取柱(Dionex, 美国);0.22ffm微孔尼龙膜(希波氏,天津富集). D一甘露糖醇(≥99,Sigma-Aldrich);D一阿拉伯 糖(≥98,Sigma);D一半乳糖(≥99,Sigma— Aldrich);D一葡萄糖(≥99.5,Sigma);D一甘露糖(≥ 99V00,Sigma);D一果糖(≥99,Sigma). NaOH水溶液(质量分数50,Fluka);质量分 数98HSO(优级纯,北京化工厂);NaN.(≥ 99.5,Fluka). 生蔓鲞蔓!塑(璺差塑!l147 1.2标准溶液和淋洗液配制 甘露糖醇,阿拉伯糖,半乳糖,果糖,葡萄糖,甘露 糖的标准储备液1000mg/L:准确称取标准物质 0.1000g溶于20mg/LNaN.溶液中,并稀释到1.0 mL,摇匀备用. 质量分数72H.SO:由98H.SO与超纯 水按照体积比2:1混合而得. 250mmol/LNaOH溶液:取5ONaOH溶液 13.0mL于盛