低熔点琼脂糖凝胶法.PPT

实验五 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段 质粒DNA的连接和转化 第一部分 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 ——玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶 中DNA片段 实验目的： 掌握利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段的原理和操作技术; 了解其他几种方法的原理与操作技术。 DNA片段分离回收常用方法： 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法 玻璃奶法 电洗脱法 将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相。 回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。 低熔点琼脂糖凝胶法 将切好的回收胶块放在回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。 待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后，在长波紫外灯下切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的EP管中，加300 μL TE。 65℃水浴10 min或更长使胶块完全融化。 酚氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。 DEAE滤膜插片法 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。 电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留。 取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。 玻璃奶法 实验原理： 玻璃奶(Glassmilk)：无毒、无味、无腐蚀作用的白色硅颗粒，能专一性结合0.2kb至50kb大小的DNA（双链、单链、线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡核苷酸、有机溶剂、去污剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物。 DNA与玻璃奶结合原理：在高盐状态下，玻璃奶周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合。在低盐（H2O/1×TE）时溶解分离。 DNA 结合率影响因素： 盐浓度： DNA100bp:高盐状态下结合率高。 DNA100bp:低盐状态下结合率高。 pH值： pH7.0:结合率高。 应 用： 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段； 从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）； DNA浓缩，去盐及去除杂质。 本方法的优点： 高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等； 简便：所需主要仪器是一架台式离心机； 快速：整个回收过程只需半个小时； 高效：回收效率达到70%以上； 多用途：可以用于胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等； 安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。 实验材料： 使用Omega bio-Tek胶回收试剂盒（Ultra-Sep Gel Extraction Kit） Ultra-Sep Binding Buffer 300ml Ultra-Sep Beads 5.5ml DNA Wash Buffer 2×80ml Elution Buffer 60ml 超纯水 无水乙醇 方法和步骤：  1．琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段。 2．紫外灯下切取所要的DNA条带。 3．将切下胶块放入1.5ml EP管中，称重，以确定胶条的体积。 设定胶的密度为1g/ml，例如0.2g胶认为其体积为0.2ml。 4.加入等体积的Ultra-Sep Binding Buffer。 对长度低于400bp的DNA片段或大于2%琼脂糖凝胶，加入3×体积的Binding Buffer。 5．涡旋震荡悬浮Ultra-Sep Beads，加入10 μl Ultra-Sep Beads到样品EP管中。50～55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴过程中，每隔2 min震荡EP管悬浮Ultra-Sep Beads。注意观察胶完全熔解后胶/ Binding Buffer混合物的pH值。当混合物pH＞8.0则DNA的产量将会显著减少。如果混合物变为橙色或红色，则加入5 μl 5M NaAC（pH5.2）以降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该变为淡黄色。 6．10,000×g室温离心1min，使Ultra-Sep Beads沉淀，弃上清。 7．加入300 μl Ultra-Sep Binding Buffer，涡旋震荡Ultr