western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版.ppt.ppt

杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 * 常用的封闭试剂有 5%的 BSA 或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 PBST 或者TBST。将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡1小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 * 一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜，根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。 * 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 5 一抗、二抗孵育 * 如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。 * 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP) 6 反应显色 * 暗室操作！ A液 B液 1 1 : 膜 混合 ECL工作液 滴加ECL工作液 显影、定影 *  在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。 * 另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 * ① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存；②?AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66micro；lNBT溶液和33micro； lBCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。 * ③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间） 除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。 * * 2×SDS上样缓冲液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰 20%甘油 ddH2O 1M Tris-HCl(pH6.8) 10 ml 1M DTT 20 ml SDS 4 g 甘油 20 ml 溴酚蓝 0.2 g 总体积 100ml 蛋白样品的变性 * DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。 * 2 SDSSDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破