第3章 从活细胞中纯化DNA.ppt

第三章 从活细胞中纯化DNA 3.1 全细胞DNA的制备 3.1.1 细菌培养物的生长和收集 确定成分的培养基(defined medium)，M9 不确定成分的培养基(undefined medium)， 如LB 蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段 酵母提取物：提供氮源，糖类以及其它有机与无机营养 3.1.2 细胞提取物的制备 细菌细胞的屏障:细胞膜和细胞壁 物理方法与化学方法 化学方法: 溶菌酶(消化细胞壁多聚物) EDTA(螯合钙离子, 抑制DNA酶的活性) SDS:去污剂,协助细胞壁的裂解 3.1.3 从细胞提取物中纯化DNA 降解杂质,留下DNA(苯酚与氯仿的混合物,RNA酶) 离子交换层析,分离DNA(带正电荷的离子交换剂) 3.1.4 DNA取样的浓缩 乙醇沉淀(破坏了DNA分子间的氢键) 3.1.5 DNA浓度的测量 A260/A280=1.8 3.1.6 制备全细胞DNA的其它方法 植物叶片用液氮碾磨成细末后转移到1.5ml离心管 加650μl 在65度预热的CTBA提取液 水浴锅中65温浴40分钟后取出，静置冷却 加入650μl苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀，静置5分钟 12000rpm 离心10 分钟 取上清液，加入2μl（10mg/ml）Rnase,37 度水浴30分钟 再抽提一次 取上清液，加入2倍体积的冷乙醇或等体积的异丙醇 轻轻摇动，待发现有白色絮状沉淀，用牙签挑出或6000rpm离心5分钟 70%的乙醇洗后，凉干。 3.2 质粒DNA的制备 3.2.1 基于分子大小的分离 3.2.2 基于构象的分离 质粒有三种构型 cccDNA(共价闭环DNA)：DNA的两条链都是完整的。 ocDNA(开环DNA)：只有一条链是完整的。 线性DNA：DNA的两条链均被打开。多种细菌中存在线性的质粒DNA。但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解。 碱变性 用CsCl-EB等密度离心 3.3 噬菌体DNA的制备 噬菌体颗粒释放在培养物物中 离心后,细菌聚集在管底 收集噬菌体,分离衣壳蛋白与DNA 3.3.1 培育培养物获得高λ噬菌体校价 够量的细菌(寄主)细胞 够量噬菌体 溶源周期向裂解周期的转化 c I 温度敏感型突变体 p43 3.3.2 非溶源性λ噬菌体的制备 基因工程用λ噬菌体载体被敲除了c I 基因，需要在培养物细菌的密度与接种体的大小之间获得正确的平衡（图3.20） 3.3.3 从被浸染培养物中收集噬菌体 加入PEG,能够吸收水分,使噬菌体颗粒大分子沉淀 3.3.4 从λ噬菌体颗粒中纯化DNA 3.3.5 M13噬菌体DNA的纯化带来的几个问题 M13噬菌体双链复制,类似质粒 M13噬菌体单链包装形成成熟的噬菌体分泌到培养基中. 培养－收集（上清）－PEG沉淀噬菌体－缓冲液重悬－苯酚除去衣壳蛋白－收集水相－加入乙醇沉淀－M13DNA重悬 * * 超螺旋 DNA 松弛cccDNA 开环DNA 核酸内切酶 DNA连接酶 核酸内切酶 DNA促旋酶 拓扑异构酶 Upper band containing chromosomal DNA and open plasmid circles Lower band of covalently closed circles plasmid DNA Ethidium bromide (EB) 包含质粒的细胞 用溶菌酶弱化细胞壁，用NaOH和SDS溶液裂解 变性的染色体 DNA 用acidic sodium acetate 中和 染色体DNA复性 形成不溶的网状物 高浓度的acidic sodium acetate使 protein-SDS 复合物和高分子量的RNA 沉淀 ccc DNA不发生变性，以天然状态溶解在溶液中 通过离心去除沉淀 通过乙醇或异丙醇浓缩沉淀，或用凝胶过滤方法纯化质粒DNA。 *